免疫学检测技术 一、抗原抗体反应 二、淋巴细胞的检测技术 三、免疫学常用的分子生物学技术

一、抗原抗体反应 抗原抗体反应的特点 特异性 可逆性 阶段性 可见现象

特异性 抗原分子上的决定簇和抗体分子V区中的超变区互相适应所决定的。 交叉反应(cross reaction)：多数的天然抗原物质,如微生物抗原,常具有多个不同的决定簇,如果两种不同的抗原物质具有部分相同或类似结构的表位，则与抗体血清反应时可出现交叉反应。

Cross reactions Anti-A Ab Ag A Ag B Shared epitope Anti-A Ab Ag C Similar epitope

可逆性（非共价键结合） 结合力的大小取决于两分子间由氢键、疏水键、静电引力和范德华力(Van der waal's force)组成的引力与电子云产生的排斥力相抵消后的合力。 抗原决定簇和抗体分子可变区之间互补的构形造成两分子之间有较强的结合力,但在一定条件下,可发生解离, 解离后的抗原和抗体性质不变。

阶段性 1、抗原抗体特异性结合阶段：此阶段需时短,仅需 几秒到几分钟,无可见反应出现。 2、可见反应阶段：需时较长,数分,数小时或数日 出现可见现象,表现为沉淀,凝集,细胞溶解等。

可见的现象 两者的分子比例密切相关。(适宜比例)

影响抗原抗体反应的因素 电解质: 温度: 酸碱度 抗原抗体适宜浓度

电解质 在中性或碱性条件下,抗原抗体均带负电荷, 适当浓度的电解质会使它们失去一部分负电荷而互相结合,出现明显的沉淀或凝集现象。若无电解质存在,则不发生可见反应,通常应用0.85%的氯化钠作为稀释液,以供给适当浓度的电解质。

温 度 适当提高反应时的温度,以增多抗原抗体分子碰撞的机会,可加速复合物体积增大,反应现象出现快。但过高温度(超过 56℃)将会使抗体或抗原变性或破坏。一般常使反应在 37℃ 水浴中进行。

酸碱度 抗原抗体反应适宜的 PH 值为 6-8,PH 值过高或过低能直接影响抗原抗体的理化性质,可引起非特异性酸凝集,造成假象,影响反应的可靠性。

抗原－抗体反应的分类 沉淀反应 凝集反应 免疫标记技术

沉淀反应 概念：可溶性抗原与相应抗体在电解质存在 的件下结合出现沉淀物的现象称沉淀反应。 分类：环状法、絮状法、 琼脂中沉淀反应。 分类：环状法、絮状法、 琼脂中沉淀反应。 用途：检测体液中各种蛋白的含量 AFP,HBsAg。

琼脂沉淀反应的分类 双向免疫扩散(double immunodiffusion) 单向免疫扩散(singleradialimmunodiffusion) 对流免疫电(counterimmunoelectrophoresis) 火箭电泳(rocket electrophoresis) 免疫电泳(immunoelectrophoresis)

双向免疫扩散(double immunodiffusion) 加入定量的抗体在中间孔，按一定距离在四周打数个小孔，分别加入不同稀释度的抗原可见粗细不等的沉淀线，从而可判定抗原的效价。

定性实验 常用于检测两种抗原的相关性

单向免疫扩散(single radialimmunodiffusion）

概念及原理: 适宜浓度的抗体预先在琼脂中混匀后制成琼脂凝胶板，以适当距离打孔，将可溶性抗原至孔中，抗原向周围扩散，与琼脂中抗体相遇，开始时形成可溶性的抗原－抗体复合物（抗原过量）当更多的抗原到达，与抗体比例适宜时，出现晶格和沉淀。可测定抗原的灵敏度约为10～20μg／ml. 应用: 常用于人或动物血清中IgG、IgM、IgA和 C3 的定量检测。缺点需要经1～2天结果。

对流免疫电泳(counterimmunoelectrophoresis)

概念: 在电场中进行的双向免疫扩散。 原理: 将抗原加至近阴极孔内，抗体加至近阳极孔内。抗原与抗体在pH 8.6的缓冲液中均带负电荷，通电后，抗原因带负电荷向阳极泳动，而抗体球蛋白等电点高，所带负电荷少，加之分子量较大，向阳极的位移小于受电渗作用向阴极的位移，表现为向阴极泳动，形成抗原抗体相向移动，二者结合，在比例适宜处形成白色沉淀线。 优点: 本法比双向免疫扩散出结果快，只需1小时左右，灵敏度亦提高，约为10μg／ml。 电渗：电场中溶液相对于固体的移动。琼脂是酸性物质，在碱性溶液中带负电，而与它接触的溶液带正电，因此液体向阴性移动。抗原抗体进行对流，在比例合适处形成沉淀线。

火箭电泳(rocket electrophoresis) 概念: 单向免疫扩散同电泳结合在一起的方法。 原理: 抗原在含有定量抗体的琼脂中泳动，两者比例适宜时，在较短时间内生成锥形的沉淀峰。在一定浓度范围内，沉淀峰的高度与抗原含量成正比。 应用: 因需时较短，故可用于快速测定标本中抗原的含量。

免疫电泳(immunoelectrophoresis)

概念及原理:免疫电泳是一种对多种抗原成分的材料进行抗原种类分析的方法。将抗原样品在琼脂平板上进行电泳，使其中各种成分因电泳迁移率不同而分离区带。然后沿电泳方向挖一与之平行的抗体槽，加入特异性抗体做双向免疫扩散。各区带中抗原分别在不同位置与抗体相遇，在比例适宜处形成沉淀弧。根据沉淀弧的数量、位置和形状，与已知标准抗原相比，即可分析样品中的成分及其性质.。 应用: 免疫电泳主要用于血清蛋白的组分分析。

凝集反应 概念：在颗粒性抗原或吸附于颗粒上的可溶性抗原(或抗体)中加入相应的抗体(或抗原)，在电解质存在的条件下出现凝集物的现象，称凝集反应 分类：直接凝集反应 (direct agglutination)，间接(被动)凝集反应(indirect/passive agglutination)，间接凝集抑制试验(indirect agglutination inhibition )，协同凝集试验(coagglutination)，抗球蛋白试验(antiglobulin test，Coomb’s test)。  

直接凝集反应 (direct agglutination) 概念: 颗粒性抗原与相应抗体直接结合所出现的凝集现象，如红细胞凝集或细菌凝集。 分类： 玻片法：定性试验、方法简便快速，用于菌种鉴定及人ABO血型鉴定 试管法：半定量试验，常用于抗体效价的测定，诊断伤寒或副伤寒的肥达氏反应(Widal test)、诊断布氏菌病的瑞特氏反应(Wright test)　

间接(被动)凝集反应 (indirect/passive agglutination)

概念：将可溶性抗原（或抗体）吸附于一种与免疫无关的、一定大小的微粒(载体)表面，然后与相应抗体(或抗原)作用，在电解质存在的条件下即可发生凝集。抗原与相应抗体结合导致载体间接凝集，因而出现肉眼可见的反应. 载体: 红细胞, 聚苯乙烯乳胶颗粒, 活性炭 间接血凝试验：如以红细胞(O型人红细胞、羊红细胞、兔红细胞等)为载体的， 正向间接血凝：抗原＋RBC（载体）＋待测抗体 反向间接血凝：抗体＋RBC（载体）＋待测抗原 间接乳胶凝集试验：以聚苯乙烯乳胶颗粒为载体的 间接炭凝试验：以活性炭为载体　 应用: 本法用于某些传染病和原发性肝癌的早期诊断

间接凝集抑制试验(indirect agglutination inhibition ) 可溶性抗原与相应抗体充分作用后再加入抗原致敏的载体颗粒，此时因抗体已被可溶性抗原结合，不再出现载体凝集现象，过去临床常用的免疫妊娠试验即属于间接凝集抑制试验。

协同凝集试验(coagglutination) 金黄色葡萄球菌细胞壁成分中的A蛋白(SPA)能与人及多种哺乳动物(猪、兔、豚鼠等)血清中IgG类抗体的Fc段结合。IgG的Fc段与SPA结合后，其Fab段与特异性抗原结合出现特异的凝集现象。金黄色葡萄球菌是IgG抗体的载体。常用于流脑、伤寒、布氏菌病等的早期诊断。

抗球蛋白试验(antiglobulin test，Coomb’s test) 概念: 某些血球凝集反应，如Rh＋红细胞与抗Rh抗体的反应，因抗体为IgG，结合价为两价，与IgM相比，分子较小，抗体与红细胞间的结合力不能克服细胞间的排斥力，不出现红细胞凝集现象。若加入抗IgG的抗体，则可以在包被了Rh抗体的红细胞之间建立数量较多、距离较远、因而排斥力较小的联接，引起凝集现象。 种类：直接抗球蛋白试验(direct Coomb’s test)该法是直接把抗人球蛋白抗体加入患者红细胞悬液中，若红细胞已结合有IgG抗体，便发生凝集　 间接抗球蛋白试验(indirect Coomb’s test) 患者血清与已知 O 型的Rh＋红细胞反应后加入抗人球蛋白抗体，观察有无凝集现象

免疫标记技术 概 念:用荧光素、酶及放射性同位素示踪物质标记抗原(或抗体)进行抗原抗体反应，通过示踪物质来检测未知抗原或抗体的一种方法。该方法可提高灵敏度。对抗原或抗体进行定性或定量及定位。 分类： 免疫荧光技术(immunofluorescence techniques) 免疫酶技术(immunoenzymic techniques) 放射性同位素标记技术(radioisotopy-labelled techniques) 发光免疫测定(luminescent immunoassay) 免疫胶体金技术（colloidal gold/immunogold staining）

免疫荧光技术 免疫荧光技术，又称为荧光抗体法(fluorescent antibody techniques). 原理： 将荧光素与抗体结合成荧光抗体，该抗体与组织或细胞抗原反应，如发生特异性结合则不易洗去，结合了荧光抗体的组织或细胞在荧光显微镜下发出可见的荧光，从而达到抗原或抗体的检出或定位。 荧光素:异硫氰酸荧光素(fluorecein isothinocynanate,FITC)、罗达明(lissamine rhodamine ） 用途：常用于检测自身抗体、组织抗体及细胞抗原。 优点：特异性高 缺点：敏感性低，重复性差，标本保存困难。

免疫酶技术（immunoenzymatic techniques） 概念: 免疫酶技术是将抗原抗体反应与酶高效催化 底物的作用相结合的一种方法。免疫酶技术 可分为免疫酶染色和酶免疫 分类: 免疫酶染色 酶免疫测定

免疫酶染色   原理：又称免疫组化技术（immunohistochemistry technique）其原理与免疫荧光法相似，不同之处是在于用酶标记抗体，称酶标抗体。酶标抗体与抗原发生特异性结合，加入底物后，底物受酶的催化发生组织化学反应产生有色物质。 酶：辣根过氧化物酶(horseradish perroxidase,HRP)：底物为二氨基联苯胺(DAB)，可生成棕褐色沉淀物。 用途：主要用于检测细胞内、组织内的抗原（定位和定量）。

酶免疫测定：酶联免疫吸附试验（ 原理：（同前) 辣根过氧化物酶（HRP），底物：OPD→棕黄色 二氨基联苯胺→棕褐色， 碱性磷酸酶（AP），硝基苯磷酸盐→兰色 步骤: 包被：将抗原（抗体）固相化，即将抗原（抗体吸附到反应板上） 抗原抗体反应 酶促反应

特点：用途广泛，敏感性高，既可检测微量抗体或 抗原。 分类：直接法、间接法、夹心法。

直接法

间接法

双抗体夹心法

BAS-ELISA( biotin-avidin system,BAS-ELISA) 这是在ELISA中引入一个放大系统。生物素（biotin）是广泛存在于生物组织中的一种生长因子，亲和素（avidin）是从卵白中提取的一种蛋白质，也可从链霉菌培养滤液中提取链霉亲和素（streptavidin）。亲和素或链霉亲和素能与多个生物素分子结合，抗原或抗体分子又可偶联多个生物素，亲和素可大量结合抗体及酶，从而起到多级放大作用。该法具有灵敏、简便、快速的优点。

同位素标记技术   放射性同位素的高度灵敏性与抗原－抗体反应的特异性结合。 放射免疫分析(radioimmunoassay,RIA),

放射免疫分析(radioimmunoassay,RIA), 原理：放射性同位素(131Ⅰ或125Ⅰ)标记的已知标准抗原(Ag※)与待测的同样抗原(Ag)共同竞争有限数量的特异性抗体(Ab)，由于抗原抗体反应遵循质量作用定律，反应系统中加入的Ag※和Ab的量是固定的，故所形成的可溶性抗原抗体复合物(Ag※-Ab和Ag-Ab)中的Ag※的含量因待测样品中Ag的含量而改变。若待测样品中有大量的Ag，则复合物中Ag※-Ab所占份额减少，较多的Ag※呈游离状态存在。反之，若样品中Ag甚少，则大量Ag※存在于复合物中。用适当方法(硫酸铵沉淀、抗球蛋白抗体结合或用聚苯乙烯等固相材料吸附)分离免疫复合物，分别测定复合物中Ag※和游离Ag※的放射性，从标准曲线上可以查知待测Ag的含量。

 特点： 放射免疫分析灵敏度高(0.001pg／ml)，特异性强，但同位素具有不稳定，污染环境等缺点。  

发光免疫分析(luminescent immunoassay,LIA) 将发光物质(常用Luminol)标记抗体或抗原进行反应，以发光现象作为抗原抗体反应的指示系统，可定量检测抗原或抗体。其原理与免疫荧光技术、免疫酶技术和同位素标记技术相似。据发光物质的来源不同，分为化学发光(chemiluminescence)和生物发（bioluminescence）。 化学发光的原理： 发光物质在反应剂（如过氧化阴离子）激发下生成激发态分子，当这些分子回到基态时，伴随光子的释放，发生化学发光现象。常用发光剂有鲁米诺（luminol）、丫啶酯等。 用途： 用于吞噬细胞、NK细胞功能的检测，需要专门的测定仪器。

免疫胶体金技术(colloidal gold／immunogold staining 用还原法将四氯金酸(HAucl4)制成特定大小的金颗粒，该颗粒由于静电作用呈稳定的胶体状态，称为胶体金。用胶体金标记蛋白质(抗体、SPA等)，再用于免疫组织化学定位，用来测定细胞表面标志和细胞内成分。目前，多用于标记探针。胶体金探针既能应用于电镜，也能应用于光镜，甚至可以用肉眼观察，此法易行、省时、价廉、灵敏度高。

二、淋巴细胞的检测技术 （一）淋巴细胞的分离： 1. 外周血单个核细胞分离 2. 淋巴细胞亚群的分离及鉴定（表面标志选择性 1.  外周血单个核细胞分离 2. 淋巴细胞亚群的分离及鉴定（表面标志选择性 纯 化淋巴细胞亚群） E花环分离法 尼龙纤维分离法 流式细胞术(flow cytometry, FCM) 磁珠分离术

细胞分离的依据 1、细胞膜脆性：低渗液 2、细胞密度：密度离心/密度梯度离心分离法 3、细胞表面标志：流式细胞仪/磁珠 4、黏附性：黏附玻璃、塑料/尼龙毛

外周血单个核细胞分离 外周血单个核细胞分离包括：淋巴细胞和单核细胞。用Ficoll密度梯度离心法可将单个核细胞与其它细胞分开。

E 花环分离法 成熟T细胞表面的 CD2 分子是绵羊红细胞受体（E 受体），能结合绵羊红细胞形成 E 花环，经淋巴细胞分离液分离后，因E花环形成细胞比重大而沉降于管底，再以低渗法裂解T细胞周围的绵羊红细胞，即获得了纯化的 T 细胞。

尼龙纤维分离法 B 细胞和单核细胞具有易粘附特性，将淋巴细胞悬液加至尼龙纤维柱上，37℃ 作用 1-2 小时后，洗脱的为非粘附性 T 细胞

流式细胞术 (flow cytometry,FCM) 流式细胞仪(flow cytometer) 或荧光激活细胞分类仪(fluorescent activated cell sorter,FACS),是利用免疫荧光技术将光学、流体力学、电子计算机等多种现代化技术综合于一体的仪器，能对各种细胞进行客观、快速、灵敏、多参数定量测定，并能按目的高纯度地分离收集所需类型的细胞。  

原理：待检细胞悬液经多种荧光素标记的抗体染色后，在一定压力下通过进样管进入流动室，排列成单列的细胞经流动室的喷嘴流出成为细胞液滴，并与激光束相交，检测器根据激光束的散射判断液流中的细胞是否带有荧光。因荧光素发射光谱的波长不同，借助光电效应，液滴通过电场时出现不同的偏向，从而完成细胞分类收集的目的，并以数字显示细胞数量。这一技术能以每秒 5000 个细胞的速度分类收集无菌细胞，且其活性不受影响。 应用：FACS可用于Ｔ细胞、B 细胞、NK 细胞、巨噬细胞、树突状细胞的鉴定及分类收集；可用于细胞内的核酸定量; 细胞周期分析; 细胞因子和粘附分子的检测; 细胞凋亡的研究及肿瘤的早期诊断、治疗指导及预后评估。

cell Ag Fluorochrome Labeled Anti Ig Tissue Section Unlabeled Ab Green Fluorescence Intensity Number of Cells Unstained cells FITC - labeled cells Red Fluorescence Intensity Two Parameter Histogram Ag Fluorochrome Labeled Anti Ig Tissue Section Unlabeled Ab Flow Tip Laser FL Detector Light Scatter cell

磁珠分离术   直接法：将抗细胞表面分子的特异性抗体与磁性微球交联，形成免疫磁珠（immune magnetic bead, IMB），将其与细胞悬液混合共育，IMB可与表达相应表面分子的细胞结合，再以强磁场分离IMB及所结合的细胞，达到分选特定细胞的目的。 间接法：用第二抗体与磁性微粒交联，再与已结合第一抗体的细胞反应，从而对细胞进行分离。

淋巴细胞的功能测定技术 体外法： 淋巴细胞增殖实试验 细胞毒试验 酶联免疫斑点法（enzyme-linkedimmunospot, ELISPOT） 体内法： OT试验(细胞免疫） 细胞因子检测

淋巴细胞增殖试验 T细胞增殖试验 (细胞免疫) B细胞增殖试验 (体液免疫)

细胞毒试验 NK细胞的细胞毒试验 抗体依赖的细胞介导的细胞毒试验（ADCC） 补体依赖的细胞毒试验（CDC） 细胞介导的细胞毒试验

淋巴细胞增殖试验 原理：淋巴细胞在有丝分裂原或特异性抗原的作用下，细胞内核酸和蛋白质合成增加，同时细胞形态转化为原始母细胞。此实验可测定淋巴细胞的应答功能，称淋巴细胞转化试验(lymphocyte transformation test).

有丝分裂原：   Mouse Human T B ConA ++ + - PHA PWN +/- LPS SpA

测定方法： 1.   形态学 观察： 2.   3H-TdR 掺人法： 3.    MTT（WST)法：

3H-TdR 掺人法 原理：淋巴细胞被丝裂原ConA 或PHA激活后，进入细胞周期进行有丝分裂，当细胞进入S期，细胞合成DNA明显增加，在培养液中加入3H标记的DNA合成原料脱氧胸腺嘧啶核苷(TdR)，则3H-TdR a)         作为合成DNA的原料被摄入细胞，掺入新合成的DNA中，根据同位素掺入细胞的量则可推测淋巴细胞对刺激物的应答水平。掺入的同位素经β-液体闪烁仪检测。 结果判定方法：

MTT 法 原理：MTT(四甲基偶氮唑盐)能被活细胞内线粒体中的琥珀酸脱氢酶分解成兰紫色的不溶于于的化全物(甲瓒)，甲瓒可沉积于细胞内或细胞周围，所形成甲瓒的量与细胞增殖程度呈正比。用分光光度计可测出细胞的增殖力。 判定方法：  

细胞介导的细胞毒实验：(cell mediated cytotoxity) CTL对靶细胞有直接杀伤作用,能特异杀伤某些肿瘤细胞或病毒感染的细胞，CTL的细胞毒活性是评价机体细胞免疫功能的指标，测定肿瘤患者CTL对瘤细胞的杀伤作用对判断肿瘤预后及观察疗效有重要意义。

51Cr释放试验 51Cr与靶细胞培养后，它进入靶细胞，与胞浆蛋白结合，去掉游离的 51Cr，即可得到 51Cr标记的靶细胞，CTL与51Cr标记的靶细胞混合，CTL杀伤靶细胞，使 51Cr从靶细胞内释放出来，测定释放到上清中的游离的 51Cr，计算CTL的杀伤活性。释放的越多则细胞毒性越强。

NK细胞的细胞毒试验 NK细胞通过两种方式杀伤： ADCC作用杀伤靶细胞 靶细胞： 人：K562(人红白血病) 小鼠：YAC-1细胞(一种T淋巴细胞瘤)

测定方法： 活细胞染色               同位素法               MTT法

ADCC NK细胞、巨噬细胞和中性粒细胞具有杀伤作用。 ADCC用来检测它们的细胞毒性。 观察靶细胞被破坏的程度，用以来判断这们的细胞毒性  

实验方法： - 靶细胞(常用同种或异种红细胞或肿瘤细胞系) - 相应的免疫血清(IgG) -  效应细胞(NK等均具有IgG的Fc受体) 结果观察方法： -  形态学观察 -  51Cr释放法 -  血红蛋白酶释放法

（Complement dependent cytotoxity,CDC） 实验原理：细胞性抗原与特异性抗体(IgG1,2,2或IgM)结合后，可激活补体活化的经典途径，引起细胞膜受损，细胞膜通透性改变，而吸收染料，使细胞着色，胀大失去正常的折光性，为阳性细胞，根据死细胞的多少判断细胞毒性的强弱。 检测方法：显微镜

细胞因子的检测   机体的免疫细胞(如淋巴细胞、单核巨噬细胞)及非免疫细胞能产生不同种类的细胞因子，它们在免疫应答中起调控作用。细胞因子检测是判断机体免疫功能的重要指标，对某些疾病的诊断、病程观察、预后判断等是十分必要的

检测方法 生物学活性检测(Bioassay) 免疫学检测法： 分子生物学检测法： 生物芯片检测：

生物学活性检测 (Bioassay) 依赖细胞株增殖法： 某些肿瘤的细胞株必须依赖于某种细胞因子才能在体外繁殖，并且增殖程度与细胞因子含量成正比。如：IL-2→CTLL/HT2; IL-1→LBRM33-1A5；IL-6→7知-1/KD833。敏感性高，但并非每个细胞因子都有依赖株。它的增殖程度可用3H-TdR和MTT法检测。 靶细胞杀伤法： TNF 对 L929细胞的杀伤作用，可用3H-TdR和染色法 细胞病变抑制法： IFN抑制病毒所致的靶细胞病变。 细胞因子诱导产物分析法：IL-1刺激T细胞产生IL-2等。

免疫学检测法 因为细胞因子具有抗原性，所以可以应用抗原-抗体反应来定量检测。 ELISA：应用细胞因子的单克隆抗体和多克隆抗体 ELISPOT：Enzyme-linked immunospot assay,酶联免疫斑点试验 流式细胞仪

分子生物学检测法 应用细胞因子的探针进行检测： 斑点杂交 Northern blot RT-PCR Cell/tissue 原位杂交 检测mRNA or cDNA of CKs

生物芯片检测 用荧光标记的靶分子和应用细胞因子的芯片(位置和序列已知)杂交 用激光共聚焦荧光扫描 检测荧光强度 对杂交结果进行量化分析

三、免疫学常用的分子生物学方法  1．免疫印迹： 高分辩率的凝胶电流与免疫化学分析技术相结合杂交技术，具有凝胶电流分析的容量大高分辨率和免疫化学分析的敏感度高、特异性强等优点。免疫印迹技术用来检测蛋白质特性、表达及分布的最常用的方法。

实验步骤： 1． 含抗原的复合物的凝胶电泳分离：相对分子量的大小来进行分离 2． 转印：电泳后的蛋白质转移至硝纤膜上 1．  含抗原的复合物的凝胶电泳分离：相对分子量的大小来进行分离 2．  转印：电泳后的蛋白质转移至硝纤膜上 3．  抗体杂交：用酶标或同位素标记的抗体与硝纤膜杂交 4．  杂交结果分析： -              放射标记检测：125I-抗体→放射自显影 -              碱性磷酸酶：AP-NBT→深兰色 -              辣根过氧化物酶：HRP-DBA→棕黑色 -              增强化学发光(ECL)：HRP-催化化学发光物质→X线胶片感光

免疫 PCR 抗原与抗体反应与 PCR 技术相结合的一种新技术，原理同 ELISA，不同的是 PCR 的放大系统取代了酶标记的放大效应，此方法可测量微量抗原或抗体。  

实验步骤： 1. 抗原吸附于固相 2. 加入特异性抗体 3. 再加入生物素标记DNA片段结合的SPA-链霉亲和素融合蛋白 4.  DNA结合到固相上 5.  加入 DNA 片段对应的引物，进行 PCR 6.  PCR 产物的量即代表吸附于固相待测抗原量，然后和标准抗原制备的标准曲线比较，测其抗原含量。

免疫沉淀实验：(Immunoprecipitation) 主要用于蛋白质混合物中靶抗原的定性和定量。