第九章 酶免疫技术
三大经典标记技术 三大经典标记技术 发光免疫技术 酶免疫技术 放射免疫技术
第一节 酶免疫技术的特点
原理及特点 抗原抗体反应的特异性 + 酶高效催化反应的专一性 主要试剂: 酶标记的抗体或抗原 酶标物特点： 免疫学活性 酶对底物的催化活性
原理及特点 特点： 原理： 灵敏度高、特异性强、准确性好 酶标抗体（抗原）与抗原（抗体）的特异性反应 酶标记试剂能够较长时间保持稳定 操作简便、对环境没有污染。 易与其它技术偶联 衍生出适用范围更广的新方法。 原理： 酶标抗体（抗原）与抗原（抗体）的特异性反应 酶对底物的显色反应 对抗原或抗体进行定位、定性或定量的测定分析
一、酶和酶作用底物 标记酶的要求： 活性高 性质稳定 专一性强 酶催化底物的显色信号易于判断和测量 方法敏感，重复性好，简单易行 酶的底物易于配制保存，酶及底物价廉
酶和酶作用底物 常用酶 辣根过氧化物酶（HRP） 糖蛋白（主酶） 亚铁血红素（辅基） 主酶与酶活性无关 辅基是酶的活性中心 RZ值与酶活性无关，酶活性单位比RZ值更为重要 辣根过氧化物酶（HRP） RZ值：403nm （辅基） 与275nm（主酶） OD值之比 ELISA中应用最为广泛的标记用酶
酶和酶作用底物 常用酶 碱性磷酸酶（AP） 菌源性AP 肠粘膜AP β–半乳糖苷酶（β-Gal） 用于均相酶 免疫测定
酶和酶作用底物 常用底物 HRP的底物 HRP DH2+H2O2→ → → D+2H2O H2O2为受氢体，HRP对受氢体的专一性很高
酶和酶作用底物 常用底物 四甲基联苯胺 TMB HRP的常见底物 邻苯二胺 OPD 5-氨基水杨酸5-ASA 2,2′-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6)铵盐 ABTS
酶和酶作用底物 HRP的常见底物 TMB反应后显蓝色 ，加酸终止反应后变为黄色,测定波长450nm ，稳定，无致癌性，ELISA中应用最广泛的底物。 OPD反应后显橙黄色，加酸终止反应后呈棕黄色，测定波长492nm。不稳定，致癌性。
酶和酶作用底物 常用底物 经AP作用后的产物为黄色对硝基酚，最大吸收峰波长为405 nm。 AP的 对-硝基苯磷酸酯（ pNPP ） 底物 酶作用后，生成高强度荧光物 ，用荧光计 测量。 4-甲基伞酮基β-D半-乳糖苷（ 4MUG ） β-Gal 的底物
二、酶标记抗体或抗原 酶免疫技术的核心组成部分 酶结合物（conjugate） 酶标记物 通过化学反应或免 疫学反应，让酶与 抗体或抗原形成的 结合物
酶标记抗体或抗原 制备方法要求 抗原要求纯度高，抗原性完整 抗体需要特异性好、效价高、亲合力强以及比活性较高，能批量生产，易纯化。
酶标记抗体或抗原 技术方法简单、产率高，重复性好 制备方法要求 标记反应不影响酶和抗原或抗体的活性 酶标记物稳定 ，不形成聚合物
酶标记抗体或抗原 过碘酸钠法（直接法） 常用于HRP标记抗体或抗原 制备方法 戊二醛交联法
酶标记抗体或抗原 戊二醛交联法 戊二醛分子中有两个相同的醛基，可分别与HRP和蛋白质分子中的氨基结合。该法有一步法和二步法。二步法标记效率比一步法高，酶标记物质量较均一。
酶标记抗体或抗原 标记完成后应除去反应液中的游离酶、游离抗体或抗原、酶聚合物以及抗体或抗原聚合物，避免游离酶增加非特异显色，以及游离抗体或抗原起竞争作用而降低特异性染色强度 纯化及鉴定 常用的纯化方法： 葡聚糖凝胶G-200/G-150过柱层析纯化 50%饱和硫酸铵沉淀提纯
三、固相载体 固相抗体或抗原就是把抗体或抗原结合到固相载体的表面 固相抗体或抗原是非均相酶免技术中将游离和结合的酶标记物迅速分离的最常用方法
固相载体 要求 种类 结合抗体或抗原的容量大 抗体或抗原牢固地固定在其表面 不影响免疫反应性 利于反应充分进行 固相方法简便易行，快速经济 塑料制品 微颗粒 膜载体
包被与封闭 包被coating 将抗原或抗体结合于固相载体 封闭blocking 用1%～5%的牛血清白蛋白或5%～20%小牛血清消除固相载体表面未结合的位点，消除非特异性吸附
第二节 酶免疫技术分类
酶免疫技术 酶免疫组化 酶免疫测定 均 相 非均相 固相酶免疫测定 液相酶免疫测定 组织切片或其它标本中抗原的定位 液体标本中抗原或 抗体的定性和定量 固相酶免疫测定 非均相 液相酶免疫测定
一、均相酶免疫测定 用于小分子激素和半抗原（如药物）的测定 原理 酶标记物与相应的抗原或抗体结合后，标记酶的活性会发生改变，不用分离结合和游离酶标记物，通过测定标记酶的活性的改变，而确定抗原或抗体的含量。
均相酶免疫测定 酶放大免疫测定技术EMIT 克隆酶供体免疫分析 CEDIA 最具代表性的两种技术 enzyme-mutiplied immunoassay technique 克隆酶供体免疫分析 CEDIA cloned enzyme donor immunoassay
EMIT示意图
CEDIA示意图
二、非均相酶免疫测定 需分离游离与结合的酶标记物 与均相不同之处 分类：液相酶免疫测定 固相酶免疫测定 以聚苯乙烯等材料作为固相载体的酶联免疫吸附试验（ELISA） 是目前最为常用的固相酶免疫测定
第三节 酶联免疫吸附试验
一、基本原理 2 1 3 4 原理 反应 包被 洗涤 底物显色 加入待测抗体或 抗原和酶标抗原 或抗体 使结合在固相上 的抗原抗体复合物 与未结合的分离 3 底物显色 定性或定量的分析 4
二、方法类型及反应原理 三个必要试剂 固相的抗原或抗体 酶标记物（酶结合物） 酶反应的底物
ELISA检测抗原的方法 双抗体夹心法 方法：用已知抗体包被，加入待检血清，再加酶标抗体，加底物显色 应用： 二价或二价以上的较大分子抗原测定 乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、HCG等
+ - 1、已知抗体包 被于载体表面 1、已知抗体包 被于载体表面 2、加待检物无抗 原与抗体结合 2、加待检物 抗原与抗体结合 洗涤 洗涤 Y Y Y Y Y Y 2、加待检物无抗 原与抗体结合 2、加待检物 抗原与抗体结合 Y Y Y Y Y Y 洗涤 洗涤 E Y E Y E Y 3、加酶标抗体 无抗原结合 E E Y E Y 3、加酶标抗体 与抗原结合 Y Y Y 洗涤 Y 洗涤 Y Y Y E Y E Y E Y 4、加酶作用的底物 产生颜色 4、加酶作用的底物 不产生颜色 Y Y Y Y Y Y + - 双抗体夹心法测抗原
ELISA检测抗原的方法 竞争法 方法：用已知抗体包被，加入待测血清，再加酶标抗原，酶标抗原与待检物竞争与包被物结合。加底物显色。 应用：用于只有一个抗原决定簇的小分子半抗原（药物、激素等）
+ - 洗涤 洗涤 Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y 竞争法测抗原 1、已知抗体包 1、已知抗体包 被于载体表面 1、已知抗体包 被于载体表面 Y Y Y Y Y Y 2、加待检物 抗原与酶标抗 原竞争与抗体 结合 2、加待测物 和酶标抗原， 酶标抗原与抗 体结合 Y E Y E Y E E Y Y 洗涤 洗涤 3、加酶作用 的底物不显色 或显色弱 Y E Y E Y E Y E 3、加酶作用 的底物显色 Y + - 竞争法测抗原
ELISA检测抗体的方法 间接法 方法 优点 应用 用已知抗原包被，加入待测血清，再加酶标的抗人IgG（抗抗体或二抗）加底物显色。 一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体 应用 常用于HCV抗体、HIV抗体和梅毒螺旋体抗体等的测定
- 1、已知抗原吸 附于载体表面 1、已知抗体吸 附于载体表面 2、加待检物 无抗体与抗原结合 2、加待检物 有抗体与抗原结合 洗涤 洗涤 Y Y Y 洗涤 洗涤 E Y E Y E Y E Y E Y E Y 3、加酶标抗Ig 与抗体结合 3、加酶标的抗Ig 抗体 洗涤 洗涤 E Y E E Y Y 4、加酶作用的底物 不产生颜色 4、加酶作用的底物 产生颜色 Y + - 间接法测抗体
ELISA检测抗体的方法 双抗原夹心法 原理：类似双抗体夹心法 操作步骤：类似 应用：乙型肝炎表面抗体
ELISA检测抗体的方法 竞争法 原理：类似检测抗原的竞争法 应用：乙型肝炎病毒核心抗体(HBcAb)和乙型肝炎病毒e抗体(HBeAb)的检测
ELISA检测抗体的方法 捕获法 应用： 病原体急性感染诊断中的IgM型抗体 甲型肝炎HAV-IgM抗体 乙型肝炎病毒核心HBc-IgM抗体
捕获法 原理： 抗人IgMμ链抗体包被 捕获待测标本中IgM类抗体 加入特异性抗原和酶标记特异性抗原的抗体 底物显色
+ - 洗涤 洗涤 洗涤 洗涤 Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y 捕获法原理 1、固相化抗人 IgM 1、固相化抗人 IgM Y Y 2、加待测物 特异性IgM与 非特异性IgM 和抗人IgM结合 2、加待测物 只有非特异性IgM 和抗人IgM结合 Y Y Y Y 洗涤 洗涤 3、加特异性 抗原，与特异 性抗体结合 3、加特异性抗 原，不能与非 特异性IgM结合 Y Y Y Y 洗涤 洗涤 E Y E Y E Y E Y E Y 4、加酶标抗体 与特异性抗原结 合，加底物显色 4、加酶标抗体 无抗原结合， 加底物不显色 Y Y Y Y Y Y + - 捕获法原理
第四节 酶免疫测定的应用
均相酶免疫测定主要用于药物和小分子物质的检测。非均相免疫测定中的ELISA应用更为广泛，ELISA广泛用于传染病的诊断，病毒如病毒性肝炎（甲肝抗体、“乙肝三对”、丙肝抗体、丁肝抗体、戊肝抗体）、风疹病毒、疱疹病毒、轮状病毒等；细菌如结核杆菌、幽门螺杆菌等。也用于一些蛋白质检测，如各种免疫球蛋白、补体、肿瘤标志物（甲胎蛋白、癌胚抗原、前列腺特异性抗原等）。