Enzymes and Other Biocatalysts 第 五 章 酶与其他生物催化剂 Enzymes and Other Biocatalysts

酶的研究简史 公元前两千多年，我国已有酿酒记载。 1833年， Anselme Payen提纯了麦芽淀粉糖化酶（淀粉酶）。 1878年，Wilhelm Kühne首次提出Enzyme一词。 1894年， Emil Fischer证明了酶的专一性，酶与底物之间作用的锁钥关系。 1897年，Buchner兄弟用不含细胞的酵母提取液，实现了发酵。 1913年，Leonor Michaelis和Maud Menten推导出酶反应的动力学方程式。 1926~1930年，James Sumner和John H. Northrop分别将脲酶和胃蛋白酶、胰蛋白酶制成结晶，确定了酶的蛋白质本质。 1941年，George Beadle和Edward Tatum的“一个基因一个酶”假说首次将蛋白质与基因联系在一起，推动了生物化学与遗传学的结合。 1982年，Cech首次发现RNA也具有酶的催化活性，提出核酶(ribozyme)的概念。 1995年，Jack W. Szostak研究室首先报道了具有DNA连接酶活性DNA片段，称为脱氧核酶(deoxyribozyme)。

第一节 酶和酶反应简介 Introduction to Enzymes and Enzymatic Reactions

一、化学反应具有热力学和动力学特性 （一）热力学性质涉及能量平衡和反应平衡 1．反应平衡可用平衡常数来描述 反应平衡（reaction equilibrium） 任何一个化学反应在正向反应与逆向反应速率相等时，反应便不再有新的产物生成,这时的化学反应称为反应平衡。 平衡常数（equilibrium constant, Keq） 平衡常数是指化学反应达到平衡时，反应产物浓度积与剩余底物浓度积之比。

S1+S2 P1+P2 Keq= [P1]eq[P2]eq [S1]eq[S2]eq 一定的温度下，Keq与反应的初始浓度无关，它反映化学反应的本性。 Keq越大则反应越倾向于产物的生成，即正向反应进行得越完全；Keq越小则逆反应的程度越大。 Keq是化学反应可能进行的最大限度的量度。

反应物的自由能（G）与其焓（H）、温度（T）和熵（S）相关，等于其焓减去绝对温度和熵的乘积，即G = H  TS 。 2．自由能的变化是化学反应的动力 自由能（free energy） 自由能是能够用于做功的能量。 反应物的自由能（G）与其焓（H）、温度（T）和熵（S）相关，等于其焓减去绝对温度和熵的乘积，即G = H  TS 。 焓代表工质流入（或流出）开口系时传递入（或传递出）系统的能量。由于热力工程中常碰到工质连续不断流过热力设备的情况，随工质流动而转移的能量中，取决于工质热力状态的部分是焓不是热力学能，因此焓的应用比热力学能更广泛。 熵是一个抽象的物理学量，是一个通过运算推导出来的量。其物理意义代表系统的无序程度。无序程度增加，熵增；反之熵减。 比如，蜡烛、冰块融化，化学中的分解反应，乙醇和水混合等都是熵增加的过程。而与之相反的过程熵减。 在生物系统中，生物分子在等温、等压条件下，在化学反应中能量的变化可以用自由能变（ G）来量度。  G = H  TS

自由能的变化是化学反应的动力，影响化学反应的方向。  G < 0 反应为释能反应（exergonic reaction）可以自发进行  G > 0 反应为吸能反应（endergonic reaction）不能自发进行  G = 0 反应正逆向速率相等，反应处于平衡状态

反应方向与H、S和T的关系 H S  G = H  TS < 0 > 0 在任何温度下， G < 0，反应自发向右进行 反应仅在温度低于H/S时， G < 0，反应自发向右进行 反应仅在温度高于H/S时， G < 0，反应自发向右进行 在任何温度下， G > 0，反应均不能自发向右进行

3．标准自由能变与平衡常数有关 标准自由能变（G0´）是指在标准状态下的自由能变 标准状态: 压力 = 1大气压（101.3kPa） 温度 = 298K（25C） pH = 7.0 [S]=[P]=1mol/l 在S1+S2 P1+P2中 G = G0´+ RT ln [P1][P2] [S1][S2] 反应达到平衡时即 G = 0 G0´=  RT ln K’eq

（二）动力学性质是对反应速率的描述 动力学是研究化学反应速率及其影响因素的科学。 反应速率是单位体积内反应进度随时间的变化率,任何反应速率均由底物浓度和速率常数（rate constant, k）所决定。

一级反应（first-order reaction）:单底物反应 二级反应（second-order reaction） ：双底物反应 V仅依赖于一个底物浓度[S]； V = k [S] k的单位是秒1 V依赖于两个底物浓度和反应速率常数 V = k [S1][S2] k的单位是L·mol1·s1

酶只催化符合热力学条件的反应 酶促反应动力学有其独特的性质 酶促反应中的作用物称为底物,S

什么是酶? 生物催化剂 蛋白质：催化体内99%以上的反应 核酸：ribozyme，小于1%

酶学历史 1833年： 麦芽抽提液 Payen 和 Persoz 用酒精沉淀 物质（对热不稳定） 淀粉 单糖

淀粉糖化酶

1835—37年：Berzelius提出： 催化作用 catalysis 催化剂 ~ ~ ~ ~ 酶

Sumner 获诺贝尔奖 1926年 提纯脲酶 酶的提纯（性质） 酶的功能（结构） 应用、工具酶 分子酶学

绝大多数酶是蛋白质，酶有特殊的催化作用。 酶是催化剂，与普通化学催化剂有相同之处，又有独特的催化特点： 高效率 高专一性 高度不稳定性 活力可调节 三高一调

二、酶的化学本质是蛋白质 （一）结构组成仅含氨基酸组分的酶称为单纯酶 有些酶其分子结构仅由氨基酸组成，没有辅助因子。这类酶称为单纯酶（simple enzyme）。 如脲酶、一些蛋白酶、淀粉酶、酯酶和核糖核酸酶等。

（二）结构组成中既含氨基酸组分又含非氨基酸组分的酶称为结合酶 结合酶（conjugated enzyme）是除了在其组成中含有由氨基酸组成的蛋白质部分外，还含有非蛋白质部分 决定反应的特异性及其催化机制 蛋白质部分：酶蛋白 (apoenzyme) 辅助因子 (cofactor) 金属离子 小分子有机化合物 全酶 (holoenzyme) 决定反应的性 质和反应类型

辅基 (prosthetic group): 辅助因子分类 （按其与酶蛋白结合的紧密程度） 辅酶 (coenzyme): 与酶蛋白结合疏松，可用透析或超滤的方法除去。 辅基 (prosthetic group): 与酶蛋白结合紧密，不能用透析或超滤的方法除去。

一些化学稳定的小分子有机化合物是重要的辅酶或辅基。 辅酶在反应过程中可与多种酶蛋白结合，作为底物在不同的酶之间传递电子、质子或化学基团。 辅基在反应中不能离开与其结合的酶蛋白。

小分子有机化合物辅酶（辅基）的种类与作用 辅酶或辅基 缩写 转移的基团 所含的维生素 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（辅酶I） NAD+ H+，电子 烟酰胺（维生素PP） 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（辅酶II） NADP+ 黄素腺嘌呤二核苷酸 FAD 氢原子 维生素B2 焦磷酸硫胺素 TPP 醛基 维生素B1 磷酸吡哆醛 氨基 维生素B6 辅酶A CoA 酰基 泛酸 生物素 二氧化碳 四氢叶酸 FH4 一碳单位 叶酸 辅酶B12 氢原子，烷基 维生素B12

维生素与辅酶 过去的50 年中已经发现13种维生素是人类所必需的。 这些维生素是体内许多酶的辅酶成分。 因此维生素具有高效的营养价值。 是维持正常细胞功能所必需的,许多动物不能合成,必须由食物供给。

维生素与辅酶 维生素种类： 脂溶性： A、D、E、K 水溶性： Vit C Vit B 族 在体内大多数转化为辅酶,有些直接参与催化 都含有氮原子

Vit B1(硫胺素,thiamine) 硫胺素焦磷酸, thiamine pyrophosphate, TPP 作用:转酮基 举例: -酮戊二酸脱氢酶, 丙酮酸脱羧酶

Vit B2 （核黄素,riboflavin） 黄素腺嘌呤二核苷酸，flavin adenine dinucleotide， FAD ：琥珀酸脱氢酶 黄素单核苷酸， flavin mononucleotide , FMN ：NADH脱氢酶 作用：参与氧化还原反应，递氢

Vit PP（烟酰胺，尼克酰胺） 烟酰胺嘌呤二核苷酸 ：苹果酸脱氢酶 烟酰胺嘌呤二核苷酸磷酸 ：苹果酸酶 烟酰胺嘌呤二核苷酸 ：苹果酸脱氢酶 烟酰胺嘌呤二核苷酸磷酸 ：苹果酸酶 作用：参与氧化还原反应，递氢、递电子 Nicotinamide adenine dinucleotide, NAD Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, NADP

维生素 B6（吡哆醛，吡哆胺） pyridoxal,pyridoxamine 辅酶形式：磷酸吡哆醛，磷酸吡哆胺 举例：所有的转氨酶 丝氨酸羟甲基转移酶 作用：转氨基作用、脱羧作用

泛酸(pantothenic acid) 辅酶形式: 辅酶A HS~CoA：脂酰辅酶A合成酶 作用: 转酰基作用

生物素biotin 辅基形式: 与酶蛋白赖氨酸残基侧链上的氨基共价结合 举例: 丙酮酸羧化酶 作用: 羧基载体

叶酸(folic acid) 辅酶形式: 四氢叶酸： tetrahydrofolic acid , FH4 ,THFA 举例: TMP合成酶 作用: 一碳单位载体

维生素B12 （钴胺素,coholamine） 辅酶形式: 甲基钴胺素 5’-脱氧腺苷钴胺素 作用: 甲基载体

辅酶的作用 1. 参加基团的转移 催化主要是在酶活性中心进行 依靠酶活性中心的必需基团的可逆性接受和去除某些基团 单纯酶蛋白的活性中心的活性基团数量有限 需要辅酶参与构成酶活性中心 有些甚至与酶蛋白共价结合

辅酶的作用 接受基团转移的种类很多 氨基------磷酸吡哆醛 羧基------生物素 一碳单位------四氢叶酸 甲基------维生素B12 酰基-----辅酶A

辅酶的作用 2. 氧化还原作用: 实际上属于质子的转移过程 酶的活性中心起了可逆性接受质子的作用 FAD FADH2 2. 氧化还原作用: 实际上属于质子的转移过程 酶的活性中心起了可逆性接受质子的作用 FAD FADH2 NAD+ NADH + H+ NADP+ NADPH + H+

辅酶的作用 3. 第二底物的作用 有些辅酶接受某些基团后,不能依靠该酶恢复原有的结构 从而需要有其他的递氢体参与,如：谷胱甘肽 GSSG 2 GSH 其他基团的转移也有这种情况 如辅酶A参与的转酰基反应, 先形成乙酰辅酶 A, 然后再脱去乙酰基

金属酶(metalloenzyme) 金属离子与酶结合紧密，提取过程中不易丢失。 金属激活酶(metal-activated enzyme) 金属离子为酶的活性所必需，但与酶的结合不甚紧密。 金属离子的作用 稳定酶的构象； 参与催化反应，传递电子； 在酶与底物间起桥梁作用； 中和阴离子，降低反应中的静电斥力等。

金属酶和金属激活酶 金属酶 金属离子 金属激活酶 过氧化氢酶 Fe2+ 丙酮酸激酶 K+，Mg2+ 过氧化物酶 丙酮酸羧化酶 Mn2+，Zn2+ 谷胱苷肽过氧化物酶 Se 蛋白激酶 Mg2+,Mn2+ 己糖激酶 Mg2+ 精氨酸酶 Mn2+ 固氮酶 Mo2+ 磷脂酶C Ca2+ 核糖核苷酸还原酶 细胞色素氧化酶 Cu2+ 羧基肽酶 Zn2+ 脲酶 Ni2+ 碳酸酐酶 柠檬酸合酶 K+

（三）有些酶仅含一条多肽链，而另一些酶由多个亚基组成 单体酶（monomeric enzyme） 由一条多肽链组成，只具有三级结构的酶。 如核糖核酸酶、一些肠道蛋白水解酶、溶菌酶。 寡聚酶（oligomeric enzyme） 由多条相同或不同的亚基组成的酶。

多酶复合物（multienzyme complex）， 或称多酶体系（multienzyme system） 由催化不同化学反应的多种酶组成的寡聚酶。 如：丙酮酸脱氢酶复合物 同工酶（isoenzyme，isozyme） 催化相同化学反应但亚基种类不尽相同的一组酶。 多功能酶（multifunctional enzyme） 或称串联酶（tandem enzyme） 多种催化功能融合于一条多肽链的酶 如：哺乳动物脂肪酸合成酶

三、酶可按其所催化的反应类型进行分类 （一）催化氧化还原反应的酶属于氧化还原酶类 氧化还原酶类（oxidoreductases）包括催化传递电子和氢、以及需氧参加反应的酶。例如，脱氢酶类、加氧酶类、过氧化物酶和过氧化氢酶等。

（二）催化分子间基团转移的酶属于转移酶类 转移酶类（transferases）包括将磷酸基从ATP转到另外底物的激酶、加无机磷酸使化学键断裂的磷酸化酶，以及糖基转移酶、转氨酶等。

（三）水解酶类催化加水分解化学键 水解酶类（hydrolases） 按其所水解的底物不同 根据它们的作用部位 蛋白酶、酯酶、 磷酸酶、糖苷酶、 核酸酶 外切酶、内切酶

（四）裂合酶催化移出化学基团并形成双键或相反的过程 裂合酶或裂解酶类（lyases）是指催化一分子非水解地分裂成两个分子并留有双键，或相反的酶。 如：脱水酶、脱羧酶、醛缩酶 精氨酸代琥珀酸裂解酶 精氨酸代琥珀酸 精氨酸 延胡索酸

合酶（synthases） 催化反应方向相反，一个底物去掉双键，并与另一底物结合形成一个分子的酶。

（五）催化分子异构体互变的酶类属于异构酶类 异构酶类（isomerases）：催化分子内部基团的位置互变、几何或光学异构体互变、以及醛酮互变的酶类。 如：变位酶、表构酶、异构酶。

（六）催化两分子结合成一分子并偶联有高能键的水解供能的酶类属于连接酶或合成酶类 DNA连接酶、氨基酰-rRNA合成酶、谷氨酰胺合成酶属于连接酶或合成酶类（liases或synthetases）。

四、酶可按其所催化的反应类型予以命名 （一）系统名称给出酶促反应的各种信息，但较繁琐 习惯命名法，一般是按酶所催化的底物命名，在其底物英文名词上加后缀“ase” 作为酶的名称。 如：蛋白酶（protease）、磷酸酶（phosphatase） 系统命名法根据酶所催化的整体反应，按酶的分类对酶命名，每个酶都有一个名称和一个编号 。 编号中4个数字中第1个数字是酶的分类号，第2个数字代表在此类中的亚类，第3个数字表示亚-亚类，第4个数字表示该酶在亚-亚类中的序号。

酶的分类与命名举例 酶的分类 系统名称 编号 催化的反应 推荐名称 1.氧化还原酶类 (S)-乳酸：NAD+-氧化还原酶 EC1.1.1.27 (S)-乳酸+NAD+ 丙酮酸+NADH+H+ L-乳酸脱氢酶 2.转移酶类 L-丙氨酸：-酮戊二酸氨基转移酶 EC2.6.1.2 L-丙氨酸+-酮戊二酸 丙酮酸+L-谷氨酸 丙氨酸转氨酶 3.水解酶类 1,4--D-葡聚糖-聚糖水解酶 EC3.2.1.1 水解有3个以上1,4--D-葡萄糖基的多糖中1,4--D-葡糖苷键 -淀粉酶 4.裂合酶类 D-果糖-1,6-二磷酸D-甘油醛-3-磷酸裂合酶 EC4.1.2.13 D-果糖-1,6-二磷酸 磷酸二羟丙酮+D-甘油醛-3-磷酸 果糖二磷酸醛缩酶 5.异构酶类 D-甘油醛-3-磷酸醛-酮-异构酶 EC5.3.1.1 D-甘油醛-3-磷酸 磷酸二羟丙酮 丙糖磷酸异构酶 6.连接酶类 L-谷氨酸：氨连接酶（生成ADP） EC6.3.1.2 ATP+L-谷氨酸+NH3 ADP+Pi+L-谷氨酰胺 谷氨酸-氨连接酶

（二）推荐名称简便而常用 由于系统名称较烦琐，国际酶学委员会还同时为每一个酶从常用的习惯名称中挑选出一个推荐名称（recommended name） 系统名称：L-乳酸：NAD+氧化还原酶 推荐名称：乳酸脱氢酶

五、酶活性或反应分析都需测定酶反应速率 （一）酶反应速率通常用单位时间内底物减少量或产物增加量来表示 酶的活性: 以国际单位（international unit, IU）表示。 在规定的实验条件下（如温度、pH的限定和足够的底物浓度等），每分钟催化1mol底物转变成产物所需要的酶量为1个国际单位（IU）。

催量（Katal） 1催量是指在特定条件下，每秒钟将1mol底物转化成产物所需的酶量 1IU＝16.67×10－9 Kat 比活性（specific activity）：比较酶的纯度 比活性单位是每mg蛋白质所含酶的国际单位数， 其单位是IU mg 蛋白1。

（二）有三类方法对底物和产物的变化量进行检测 1．直接测定法是对底物或产物的含量变化进行直接检测 有些酶促反应可在反应进行一定时间后，不用任何辅助反应便可直接测定反应液中底物或产物的浓度。这类测定方法称为直接测定法（direct assay）。 还原型（Fe2+）细胞色素c在波长550nm处有明显的吸收峰，而氧化型（Fe3+）则无；细胞色素c氧化酶对细胞色素c的氧化反应，可以直接在波长550nm处检测一定时间内还原型细胞色素c的减少过程 。

2．间接测定法利用非酶辅助反应对底物或产物的变化进行间接检测 有些酶促反应的底物和产物不能直接进行检测，必须增加一些辅助试剂来达到检测的目的，这种方法称为间接测定法（indirect assay） 二氢乳清酸脱氢酶 二氢乳清酸 + 泛醌  乳清酸 + 泛醇 泛醇 + 2,6-二氯酚靛酚（氧化型） 泛醌 + 2,6-二氯酚靛酚（还原型） （亮蓝色，在610nm处有吸收峰） （在610nm处无吸收峰）

3．偶联测定法不直接涉及原始反应的底物或产物 许多酶促反应的底物和产物虽然不能直接检测，但可以与另外的酶反应相偶联，偶联的酶以第一个酶的产物为底物，或以此类推，以最后的酶反应产物可以直接检测为目的。这种通过偶联其他酶并对此酶促产物进行直接检测，间接地反映待测酶反应的底物或产物变化量的方法称为酶偶联测定法（enzyme coupled assay） 外加的酶称为工具酶或辅助酶（auxiliary enzyme） 产物可直接检测的酶称为指示酶（indicator enzyme） 丙氨酸转氨酶 丙氨酸 + -酮戊二酸  丙酮酸 + 谷氨酸 乳酸脱氢酶 丙酮酸 + NADH + H+  乳酸 + NAD+ （在340nm处有吸收峰） （在340nm处无吸收峰）

（三）酶联免疫分析测定蛋白质是酶分析的发展 酶联免疫分析又称酶联免疫吸附测定 （enzyme-linked immunosorbent assays, ELISA） 是利用酶的快速、灵敏、可定量检测的优点和免疫学方法中抗原-抗体特异性结合的优点，将指示酶与抗体偶连，对抗原进行检测的一种方法 。 常用的方法 将辣根过氧化物酶与抗体偶联，通过显色测定酶的活性，进而计算出与酶偶联抗体所结合的抗原的量。

Mechanism of Enzymatic Reactions 第二节 酶的工作原理 Mechanism of Enzymatic Reactions

、酶具有与一般催化剂相似的工作原理 （一）酶与一般催化剂均降低反应的活化能 1．活化能是化学反应的能障 酶和一般催化剂加速反应的机理都是降低反应的活化能(activation energy)。酶比一般催化剂更有效地降低反应的活化能。 活化能：底物分子从初态转变到活化态所需的能量。

活化能是一个能障，与反应速度成反比，外界供能一定，活化能直接决定过渡态分子的量。 酶显著降低反应的活化能 基态分子  过渡态 活化能是一个能障，与反应速度成反比，外界供能一定，活化能直接决定过渡态分子的量。 能量 搅拌，加热 活化能

酶促反应活化能的改变 能 量 结合能 非催化反应活化能 底物 反应总能量改变 产物 反 应 过 程 一般催化剂催 化反应的活化能 酶促反应 反 应 过 程 底物 产物 酶促反应活化能的改变 结合能

在标准状态下反应活化能降低1倍，反应速率可提高约5000倍，呈现指数上升。 2．活化能的降低可使反应速率呈指数上升 化学反应速率与自由能变化的关系 d[S] kBT V =   =  [S] e G*/RT dt h [S]代表底物（substrate）浓度 kB是玻尔茨曼常数（Boltzmann constant）（1.3811023JK-1） h是普朗克常数（Planck constant）（6.626 1034J.s） G*代表反应的活化能 在标准状态下反应活化能降低1倍，反应速率可提高约5000倍，呈现指数上升。 一般讲，酶的催化效率比非催化反应高1051017倍

（二）酶与一般催化剂均可加速反应到达反应平衡点 酶与一般催化剂一样，只能加快反应速率，使其缩短到达反应平衡的时间，而不能改变反应的平衡点。 反应达到平衡时自由能的变化仅取决于底物与产物的自由能之差。 任何催化剂都不能改变底物和产物自身的自由能。

二、酶促反应具有高度的特异性和高效率 （一）酶活性中心是酶与底物结合并将底物 转化为产物的部位 酶的活性中心(active center) 或称活性部位(active site)，指若干个必需基团在空间结构上彼此靠近，组成具有特定空间结构、能与底物特异结合并将底物转化为产物的区域。 酶的活性中心(active center)

1．酶的活性中心由许多必需基团组成 必需基团(essential group) 酶分子中氨基酸残基侧链的化学基团中，与酶活性密切相关的化学基团。 常见的必需基团 丝氨酸残基的羟基 组氨酸残基的咪唑基 半胱氨酸残基的巯基 酸性氨基酸残基的羧基

活性中心内的必需基团 结合基团 (binding group) 与底物相结合 催化基团 (catalytic group) 催化底物转变成产物 活性中心外的必需基团 位于活性中心以外，维持酶活性中心应有的空间构象所必需。

底 物 活性中心以外的必需基团 催化基团 结合基团 活性中心

2．酶的活性中心是酶分子中具有三维结构的很小区域 溶菌酶的活性中心 组成酶活性中心的必需基团在一级结构上可能相距很远，但在形成三级结构时相互接近，形成具有三维结构的区域，且多是酶分子中的裂隙或凹陷所形成的疏水口袋。

3．酶的活性中心对底物具有高度的特异性 酶活性中心与底物结合时，发生构象改变， 相互诱导契合，增加与底物的互补性 4．大多数情况下底物与酶活性中心最初的结合是非共价性的 氢键 离子键 疏水键 van der Waals力 酶与底物结合的力

E + S E + P ES （二）酶-底物相互作用在过渡态达到最优化 1．酶与底物结合时相互诱导发生构象改变 酶-底物复合物 诱导契合假说（induced-fit hypothesis） 酶与底物相互接近时，其结构相互诱导、相互变形和相互适应，进而相互结合。这一过程称为酶-底物结合的诱导契合假说 。

羧肽酶的诱导契合模式 Arg145胍基 Tyr248-OH Glu270- COO- 底物

2．形成酶-底物过渡态复合物过程中释放结合能 底物与酶的活性中心相互诱导契合形成过渡态化合物，过渡态与酶的活性中心以次级键(氢键、离子键、疏水键)相结合，这一过程是释能反应，所释放的能量称为结合能(binding energy)。 结合能可以抵消一部分活化能，是酶反应降低活化能的主要能量来源。 酶不能使底物形成过渡态，则没有结合能的释放，也就不能催化反应的进行。

3．邻近效应、定向排列和表面效应有利于底物形成过渡态 邻近效应（proximity effect）和定向排列（orientation arrange）将分子间的反应变成类似分子内的反应，使反应速率显著提高。

趋近和定向效应 指底物和酶的活性中心“ 靠近”和“ 定向” 酶与底物之间的亲和力使底物与酶靠近，局部微环境浓度 酶与底物结合后，酶的构象会发生微小的变化，使底物反应基团或部位正确定向于酶活性中心 双底物也能正确定位与酶的活性中心 靠近的反应基团和正确的定向使反应速度

趋近和定向效应 在酶反应体系中：底物与酶随机碰撞 底物 B 底物 A 酶活性中心

酶与底物间的亲和力 使二者靠近，并选择 最佳定向 底物 B 底物 A 底物 A 底物 B 酶活性中心 酶活性中心 不正确定向 正确定向

趋近和定向效应 A B 趋近，局部浓度 酶活性中心 A、B分子间反应分子内反应 分子间反应：要求底物浓度103~108M 分子内反应：与底物浓度无关 亲和力

趋近和定向效应 酶与底物结合后，酶的构象会发生变化，使底物的反应基团互相有一个最易起反应的方向，与此同时，E、S达到最大互补。 自由度 最适取向，反应速度

在疏水环境中进行酶反应有很大的优越性，此现象称为表面效应（surface effect）。 酶的活性中心多位于其分子内部的疏水“口袋”中，酶反应在酶分子内部的疏水环境中进行。 疏水环境可使底物分子脱溶剂化（desolvation）。排除水分子的干扰，防止酶和底物分子之间形成水化膜。

（三）酶活性中心催化基团通过多种途径催化产物的生成 1．质子转移反应都包含广义酸-碱催化反应 酶是两性解离的蛋白质，酶活性中心上有些基团是质子供体（酸），有些是质子接受体（碱）。 这些基团在酶活性中心的准确定位有利于质子的转移，这种广义酸-碱催化（general acid-base catalysis）可以使反应速率提高102105倍。

酶分子中具有酸-碱催化作用的基团 氨基酸残基 酸（质子供体） 碱（质子接受体） 谷氨酸、天冬氨酸 RCOOH RCOO 赖氨酸、精氨酸 半胱氨酸 RSH RS 组氨酸 丝氨酸 ROH RO 酪氨酸 R N H H + R NH 2 .. CH NH HN C R + CH N： HN C R OH R O- R

2．酶可与底物形成瞬时共价键 很多酶在催化过程中，与底物形成瞬时共价键，底物与酶形成共价键后被激活，并很容易进一步水解形成产物和游离的酶。这种催化机制称为共价催化（covalent catalysis）。 AB + E： AE + B H2O AE  A + E：+ B

酶的亲核基团与底物共价结合 酶举例 亲核基团 共价结合中间产物 丝氨酸蛋白酶 丝氨酸OH 酰基酶 巯基酶 半胱氨酸SH ATP酶 天冬氨酸COO 磷酰基酶 含吡哆醛的酶 赖氨酸NH2 Schiff碱 磷酸甘油酸变位酶 组氨酸 谷氨酰胺合成酶 酪氨酸OH 腺嘌呤酶

3．酶可通过亲核催化或亲电子催化加速反应 酶活性中心有的催化基团属于亲核基团，可以提供电子给带有部分正电荷的过渡态底物，形成瞬间共价键。这种催化作用称为亲核催化（nucleophilic catalysis）。 亲电子催化（electrophilic catalysis）可使酶活性中心的阳离子亲电子基团与富含电子的底物形成共价键。

胰凝乳蛋白酶的亲核催化、共价催化和酸-碱催化机制 His57碱催化 + Ser195共价催化

三、酶对底物有高度的选择性 酶的特异性或专一性（specificity） 酶对其所催化的底物和反应类型具有严格的选择性，一种酶只作用于一种化合物，或一类化学键，催化一定的化学反应并产生一定结构的产物的现象。

（一）有的酶对其底物和反应类型具有极其严格的选择性 有的酶仅对一种特定结构的底物起催化作用，产生具有特定结构的产物。酶对底物的这种极其严格的选择性称为绝对特异性（absolute specificity）。 脲酶仅水解尿素，对甲基尿素则无反应。

绝对特异性 脲酶、L-精氨酸酶： L-精氨酸  L-鸟氨酸 + 尿素 NH2 C = O + H2O  CO2 + 2NH3 C=O NH CH3

（二）多数酶具有相对特异性 多数酶可对一类化合物或一种化学键起催化作用，这种对底物分子不太严格的选择性称为相对特异性（relative specificity）。 脂肪酶不仅水解脂肪，也可水解简单的酯。 胰蛋白酶水解由碱性氨基酸（精氨酸和赖氨酸）的羧基所形成的肽键。

人体内有多种蛋白激酶，它们均催化底物蛋白质 丝氨酸（或苏氨酸）残基上羟基的磷酸化 蛋白激酶 共有序列 蛋白激酶A -X-R-(R/K)-X-(S/T)-X- 蛋白激酶C -X-(R/K1-3,X0-2)-(S/T)-(X0-2,R/K1-3)-X 蛋白激酶G -X-(R/K)2-3-X-(S/T)-X- Ca2+/钙调素蛋白激酶H -X-R-X-X-(S/T)-X-

（三）有些酶仅对底物分子的某种构型起催化作用 酶对空间构型所具有的特异性要求称为空间异构特异性（stereo specificity） 延胡索酸酶仅对延胡索酸(反丁烯二酸)起催化作用，将其加水生成苹果酸，对顺丁烯二酸则无作用

延胡索酸酶 延胡索酸 CH2COOH HOOCCH CH  COOH HCCOOH + H2O  OH L-Mal HOOCCH

The Kinetics of Enzymatic Reactions 第三节 酶促反应动力学 The Kinetics of Enzymatic Reactions

一、采用酶促反应初速率来研究酶促反应动力学 概念 研究各种因素对酶促反应速率的影响，并加以定量的阐述。 影响因素包括有 酶浓度、底物浓度、pH、温度、抑制剂、激活剂等。 ※ 研究一种因素的影响时，其余各因素均恒定。

研究前提 单底物、单产物反应； 酶促反应速率（velocity，V）一般在规定的反应条件下，用单位时间内底物的消耗量和产物的生成量来表示； 反应速率取其初速率，即底物的消耗量很小（一般在5﹪以内）时的反应速率； 底物浓度远远大于酶浓度。

二、酶促反应速率受底物浓度的影响 （一）酶促反应的底物浓度曲线是矩形双曲线 在酶浓度和其他反应条件不变的情况下，反应速率V对底物浓度[S]作图呈矩形双曲线。

反应速率与底物浓度成正比；反应为一级反应。 V Vmax [S] 当底物浓度较低时 反应速率与底物浓度成正比；反应为一级反应。 目 录

反应速率不再成正比例加速；反应为混合级反应。 [S] V Vmax 随着底物浓度的增高 反应速率不再成正比例加速；反应为混合级反应。 目 录

酶被底物所饱和，反应速率不再增加，达最大速率；反应为零级反应。 [S] V Vmax 当底物浓度高达一定程度 酶被底物所饱和，反应速率不再增加，达最大速率；反应为零级反应。 目 录

（二）底物浓度与反应速率的关系可用米氏方程式表示 1．米氏方程式可以很好地解释底物浓度曲线 中间产物 酶促反应模式——中间产物学说 E + S k1 k2 k3 ES E + P

※1913年Michaelis和Menten提出反应速率与底物浓度关系的数学方程式，即米-曼氏方程式，简称米氏方程式(Michaelis equation)。 Ｖ Vmax[S] Km + [S] ＝ ── [S]：底物浓度 V：不同[S]时的反应速率 Vmax：最大反应速率(maximum velocity) Ｋm：米氏常数(Michaelis constant)

米-曼氏方程式推导基于两个假设： E与S形成ES复合物的反应是快速平衡反应，而ES分解为E及P的反应为慢反应，反应速率取决于慢反应。即 V＝k3[ES] (1) S的总浓度远远大于E的总浓度，因此在反应的初始阶段，S的浓度可认为不变即[S]＝[St]。

稳态：是指ES的生成速率与分解速率相等，即 [ES]恒定。 k1 ([Et]－[ES]) [S]＝k2 [ES] + k3 [ES] 2．稳态的概念介入米氏方程式的推导过程 稳态：是指ES的生成速率与分解速率相等，即 [ES]恒定。 k1 ([Et]－[ES]) [S]＝k2 [ES] + k3 [ES] (2) ＝ ([Et]－[ES])[S] k2+k3 [ES] k1 整理得： k2+k3 ＝ Km （米氏常数） k1 令： 则(2)变为: ([Et]－[ES]) [S] ＝Km [ES]

[ES]＝─── k3[Et][S] Km + [S] (3) 整理得: 将(3)代入(1) 得 k3[Et][S] Km + [S] (4) V＝──── 当底物浓度很高，将酶的活性中心全部饱和时，即[Et]＝[ES]，反应达最大速率 Vmax＝k3[ES]＝k3[Et] (5) Vmax[S] Km + [S] V＝──── 将(5)代入(4)得米氏方程式：

（三）动力学参数可用来比较酶的动力学性质与活性 1．Km值相当于V为Vmax一半时的[S] Vmax V [S] Km Vmax/2 2 ＝ Km + [S] Vmax Vmax[S] Km＝[S] ∴Km值等于酶促反应速率为最大反应速率一半时的底物浓度，单位是mol/L。

2．Km是酶的特征性常数 在酶的结构、溶液pH、温度等条件不变的情 况下，酶促反应底物的Km不因反应中酶浓度的改 变而不同。 同一酶对其所催化的不同底物有不同的Km； 不同酶对同一底物也有其各自的Km 。 Km只与酶和底物的种类以及反应环境（ pH、温 度、离子强度）有关，而与酶浓度无关。 Km的范围多在10-6～10-2mol/L之间。

一些酶的底物的Km 6.0  103 己-N-乙酰2葡萄糖胺 溶菌酶 2.5  102 H2O2 过氧化氢酶 4.0  103 D-乳糖 -半乳糖苷酶 2.5  103 N-苯甲酰酪氨酰胺 1.08  101 甘氨酰酪氨酰甘氨酸 胰凝乳蛋白酶 2.6  102 HCO3 碳酸酐酶 1.5  103 D-果糖 5  105 D-葡萄糖 4  104 ATP 己糖激酶（脑） Km（mol/L） 底物 酶

3．Km在一定条件下可表示酶对底物的亲和力 1 K m = 2 + 3 当k3 << k2时，Km  k2/k1。即相当于ES分解为E + S 的解离常数（dissociation constant, Ks）。此时，Km代表酶对底物的亲和力。 Km越大，表示酶对底物的亲和力越小； Km越小，表示酶对底物的亲和力越大。

4．kcat代表酶的转换数 kcat = Vmax /[Et] kcat表示酶被底物完全饱和时，单位时间内每个酶分子（或活性中心）催化底物转变成产物的分子数。 kcat也称为酶的转换数(turnover number)，单位是s1 。 多数酶的转换数在1104 s1之间

一些酶的转换数 酶 底 物 转换数 （s1） 过氧化氢酶 H2O2 40 000 000 碳酸酐酶 HCO3 400 000 乙酰胆碱酯酶 乙酰胆碱 14 000 -内酰胺酶 苄青霉素 2 000 延胡索酸酶 延胡索酸 800 Rec A蛋白 ATP 0.4

[ E ] S K V = k 5．在低底物浓度时，kcat/Km代表酶的催化效率 当[S]<< Km时 kcat/Km是此二级反应的速率常数，也称特异性常数，其单位是L·mol1· S1 。 反应速率的大小取决于E和S由于相互渗透而相互碰撞的速率。.这种被渗透控制的碰撞速率(diffusion-controlled rate of encounter，DCRE)的上限是108109L·mol1·s1。kcat/Km越接近此数据，酶的催化效率越高。

一些kcat/Km值接近DCRE的酶 酶 kcat/Km （L·mol1·S1） 乙酰胆碱酯酶 1.6  108 碳酸酐酶 8.3  107 过氧化氢酶 4  107 巴豆酸酶 2.8  108 延胡索酸酶 磷酸丙糖异构酶 2.4  108 -内酰胺酶 1  108 超氧化物岐化酶 7  109

（四）酶促反应动力学参数可用作图法求得 1．双倒数作图法是求取Vmax和Km的最常用方法 林-贝方程式（Lineweaver-Burk equation） 将米氏方程式两边取倒数，并加以整理，则得出米氏方程式的双倒数形式 ： V 1 = K m a x [ S ] +

直线在纵轴的截距等于1/Vmax，而在横轴上的截距为1/Km

2．其他一些作图法也可较准确地求取Vmax和Km 海涅斯-沃尔弗作图法（Hanes-Wolff plot） 双倒数方程式两边同时乘以[S] [ S ] V = K m a x + 1

直线的斜率等于1/Vmax，横轴截距为-Km

伊迪-霍夫斯蒂作图法（Eadie-Hofstee plot） V = [ S ] m a x K

直线的斜率为-Km，直线的纵轴截距为Vmax

三、酶促反应速率与酶的浓度相关 当[S]＞＞[E]，酶可被底物饱和的情况下，反应速率与酶浓度成正比。 关系式为：V = k3 [E]

A：底物浓度曲线，其中，[E]1 > [E]2 > [E]3。从图中可知， [E]的变化不影响酶促反应的Km。 B：反应速率对酶浓度作图，V与[E]呈直线关系。

四、酶促反应速率受反应系统温度的影响 双重影响 温度升高，酶促反应速率升高；由于酶的本质是蛋白质，温度升高，可引起酶的变性，从而反应速率降低 。 最适温度 (optimum temperature)： 酶促反应速率最快时的环境温度。

哺乳动物组织中酶的最适温度多在35～40℃之间 Taq DNA聚合酶最适温度为72℃ * 低温的应用 一般的酶在低温下活性降低，但酶本身不被破坏，其活性可随温度的回升而恢复。 低温保存酶和菌种等生物制品 低温麻醉

五、酶的活性依赖于反应系统的pH 最适pH (optimum pH)： 酶催化活性最大时的环境pH。 体内酶的最适pH多在6.5～8之间。

六、激活剂可加速酶促反应速率 酶的激活剂（activator） 使酶从无活性变为有活性或使酶活性增加的物质 必需激活剂（essential activator） 为酶促反应所必需，如缺乏则测不到酶的活性。 Mg2+为己糖激酶的必需激活剂 非必需激活剂（non-essential activator） 可以提高酶的催化活性，但不是必需的。 Cl-对唾液淀粉酶的激活作用

七、酶活性可被许多抑制剂可逆地或不可逆地抑制 （一）可逆性抑制剂与酶非共价结合 酶的抑制剂(inhibitor) 凡能使酶的催化活性下降而不引起酶蛋白变性的物质称为酶的抑制剂。 区别于酶的变性 抑制剂对酶有一定选择性 引起变性的因素对酶没有选择性

可逆性抑制（reversible inhibition） 酶与抑制剂非共价结合，可以通过透析、超滤或稀释等物理方法将抑制剂除去，恢复酶的催化活性。 不可逆性抑制（irreversible inhibition） 与酶共价结合，不能通过透析、超滤或稀释等方法将其除去。

抑制剂与酶的调节部位结合，使酶发生变构，从而对酶发挥抑制作用（别构抑制作用）。 可逆性抑制剂 抑制剂与酶的调节部位结合，使酶发生变构，从而对酶发挥抑制作用（别构抑制作用）。 抑制剂通过与游离酶或/和酶-底物复合物可逆地结合而影响酶的催化活性。 k 1 2 3 + i E I S P ' 可逆性抑制作用的抑制剂可以与游离酶结合，形成二元复合物EI；也可以与ES结合，形成三元复合物ESI。

+ 1．竞争性抑制剂与底物竞争酶的活性中心 定义： 抑制剂与底物的结构相似或部分相似，能与底物竞争酶的活性中心，从而阻碍酶-底物复合物的形成，使酶的活性降低。这种抑制作用称为竞争性抑制作用。 + E S I ES EI E P

反应模式 有竞争性抑制剂存在的米氏方程式 双倒数方程式是 + E + S ES E + P I EI k i 1 2 3 S V = m a x [ S ] K + ( 1 I k i ) 双倒数方程式是 V m a x K [ S ] 1 = + ( I k i )

I与S结构类似，或部分相似，竞争酶的活性中心； * 特点 [I] 1 V [S] K m (1+ ) k i max - I与S结构类似，或部分相似，竞争酶的活性中心； 抑制程度取决于抑制剂与酶的相对亲和力及底物浓度； 竞争性抑制作用V对[S]的双倒数作图 动力学特点：Vmax不变，表观Km增大。

* 举例 丙二酸与琥珀酸竞争琥珀酸脱氢酶 琥珀酸 琥珀酸脱氢酶 FAD FADH2 延胡索酸

磺胺类药物的抑菌机制 与对氨基苯甲酸竞争二氢叶酸合成酶 二氢蝶呤 ＋ 对氨基苯甲酸 ＋ 谷氨酸 二氢叶酸 合成酶

+ S + 2．非竞争性抑制剂不影响酶对底物的亲和力 * 反应模式 － S ESI EI E ES P k 1 2 3 + i E I S

抑制剂与酶活性中心外的必需基团结合，底物与抑制剂之间无竞争关系； 非竞争性抑制的米氏方程式的双倒数形式 V m a x K [ S ] 1 = + ( I k i ) * 特点 抑制剂与酶活性中心外的必需基团结合，底物与抑制剂之间无竞争关系； [I] 1 V [S] K m (1+ ) k i max 非竞争性抑制作用V对[S]的双倒数作图 抑制程度取决于抑制剂的浓度； 动力学特点：Vmax降低，表观Km不变。

3．反竞争性抑制剂只与酶-底物复合物结合 + E S ES ESI P * 反应模式 k 1 2 3 + E S P I i

反竞争性抑制作用的米氏方程式的双倒数形式 V m a x K [ S ] 1 = + ( I k i ) * 特点： 抑制剂只与酶-底物复合物结合； [I] 1 V [S] K m (1+ ) k i max 反竞争性抑制作用V对[S]的双倒数作图 抑制程度取决于抑制剂的浓度及底物的浓度； 动力学特点：Vmax降低，表观Km降低。

各种可逆性抑制作用的比较 动力学参数 表观 Km K 增大 不变 减小 最大速度 V 降低 林 - 贝氏作图 斜率 / 纵轴截距 1/V max 降低 林 - 贝氏作图 斜率 / 纵轴截距 1/V 横轴截距 1/K 与 I 结合的组分 E 、 ES 作用特征 无抑制剂 竞争性抑制 非竞争性抑制 反竞争性抑制

（二）不可逆性抑制剂与酶共价结合 不可逆性抑制作用的抑制剂 基团特异性抑制剂（group-specific inhibitor） 底物类似物（substrate analog） 自杀性抑制剂（suicide inhibitor）

1．基团特异性抑制剂与酶分子中特异的基团共价结合 一些酶活性中心的催化基团是丝氨酸残基上的羟基，这些酶称为羟基酶。 如胆碱酯酶和丝氨酸蛋白酶 有机磷化合物 羟基酶 失活的酶 酸 C H 3 CH N + HON RO P R'O O E C H 3 OH 解磷定 失活的酶 有机磷-解磷定复合物 活化的酶

半胱氨酸残基上的巯基是许多酶的必需基团。低浓度的重金属离子(Hg2+、Ag2+、Pb2+等)及As3+等可与巯基酶分子中的巯基结合，使酶失活。 路易士气 巯基酶 失活的酶 酸 失活的酶 BAL 巯基酶 BAL与砷剂结合物

2．底物类似物可共价地修饰酶的活性中心 与基团特异性抑制剂不同，底物类似物与底物的结构相似，可特异地与酶的活性中心共价结合，不可逆地抑制酶的活性。此类抑制剂可作为亲和标记物，用来定性酶活性中心的功能基团。 TPCK对胰凝乳蛋白酶活性中心组氨酸咪唑环的亲和标记

3．自杀性抑制剂是经过修饰的酶的底物 酶的自杀性抑制剂可以作为酶的底物与酶活性 中心相结合，生成酶-底物复合物，并接受酶的催化 作用。然而，经催化后的中间产物不游离出产物， 而是转化为酶的抑制剂，进一步与酶活性中心共价 结合，对酶产生抑制作用。 E + S ES  E·I  E-I

单胺氧化酶通过其辅基FAD氧化N,N-二甲基丙炔酰胺(N,N-dimethylpropargyl amine)： + N，N-二甲基丙炔酰胺 酶-底物复合物 无活性酶中 被修饰的FAD   自杀性抑制剂N,N-二甲基丙炔酰胺在被单胺氧化酶氧化后，由于填加1个质子，使之与酶的辅基FAD结合生成稳定的烷化物，从而酶被抑制。

Kinetics of Multisubstrate Reactions 第四节 多底物反应的动力学 Kinetics of Multisubstrate Reactions

一、多底物反应有其特定的表示法 双底物和多底物反应的表示法与前述的单底物反应不同，用A、B、C表示底物，用P、Q、R表示产物。双底物和多底物反应用单(uni)、双(bi)、三(ter)等表示底物和产物的数量。 酶促反应的一般名称举例 反 应 名 称 A  B 单单反应（uni uni reaction） A + B  P 双单反应（bi uni reaction） A + B  P + Q 双双反应（bi bi reaction） A + B + C  P + Q 三双反应（ter bi reaction） A + B + C  P + Q + R 三三反应（ter ter reaction）

二、双双反应可按底物与酶结合和产物释放的顺序进行分类 （一）有序序列双双反应中底物结合和产物释放有严格的先后次序 有些酶促双双反应中，两底物与酶的结合和两产物从酶-底物复合物中的释放有其严格次序，这类双双反应称为有序序列双双反应(compulsory ordered bi bi reaction)，或称有序序列机制(compulsory ordered mechanism)。

乳酸脱氢酶催化的反应 丙酮酸 + NADH + H+ 乳酸 + NAD+

（二）随机序列双双反应的底物结合和产物释放没有严格的先后次序 有些酶促双双反应中，两底物与酶结合和两产物释放的次序是随机的，这类双双反应称为随机序列双双反应(random ordered bi bi reaction)，或称随机序列机制(random ordered mechanism)。

（三）乒-乓双双反应的两底物尚未全部与酶结合便有产物释放 有些酶促双双反应中，两底物与酶的结合和两产物从酶-底物复合物的释放是交替进行的，这类双双反应称为乒-乓双双反应(Ping-Pong bi bi reaction)，或双置换机制(double displacement mechanism)。

Regulation of Enzyme Activities 第五节 酶活性的调节 Regulation of Enzyme Activities

一、调节酶的催化活性随着对环境信号的 反应而变化 调节酶（regulatory enzyme） 对环境因素的作用表现出催化活性增高或降低、或酶量的增多或减少，进而能影响和调整反应途径反应速率的酶。 机体通过改变调节酶的活性或诱导、阻遏酶的生物合成，可实现细胞代谢水平的调节；物质代谢的整体调节和激素水平的调节最终也都是通过影响酶促反应速率实现的。

酶的调节 酶活性调节： 抑制 抑制剂 激活 激活剂 双重调节 别构调节 共价修饰 多形性调节 酶原的激活 同工酶 酶含量调节： 抑制 抑制剂 激活 激活剂 双重调节 别构调节 共价修饰 多形性调节 酶原的激活 同工酶 酶含量调节： 调节合成：诱导、阻遏 调节降解

二、别构酶通过构象的改变影响酶促反应速率 （一）别构效应剂与别构酶结合引发酶的构象改变 别构调节 (allosteric regulation) 一些代谢物可与某些酶分子活性中心外的某部分可逆地结合，使酶构象改变，从而改变酶的催化活性，此种调节方式称别构调节。

别构酶（allosteric enzyme）：能发生别构效应的酶 别构效应剂（allosteric effector） ： 能引起酶发生构象改变的化合物 调节部位（regulatory site） ： 别构效应剂与酶结合的部位 别构酶也有两种构象形式，紧缩态(tense state, T state)和松驰态(relaxed state, R state)。T态和R态对底物的亲和力或催化活性不同，别构效应剂就是通过引起酶R态与T态的互变，改变酶的催化速率。

（二）别构效应剂可引起别构酶分子中各亚基间的协同作用 亚基的构象改变可以相互影响，发生协同效应。（cooperativity） 正协同效应（positive cooperativity） 后续亚基的构象改变增加其对别构效应剂的亲和力，使效应剂与酶的结合越来越容易。 负协同效应（negative cooperativity） 后续亚基的构象改变降低酶对别构效应剂的亲和力，使效应剂与酶的结合越来越难。

同种协同效应（homotropic cooperativity） 别构效应剂引起的构象改变增加或降低后续亚基对同种别构效应剂的亲和力。 异种协同效应（heterotropic cooperativity） 别构效应剂引起的构象改变增加或降低后续亚基对他种别构效应剂的亲和力。

别构效应剂引起的构象改变增加酶对底物的亲和力，这种现象（属于异种正协同效应）称为别构激活作用（allosteric activation）。此别构效应剂称为别构激活剂（allosteric activator） 引起酶对底物亲和力降低的现象（属于异种负协同效应）称为别构抑制作用（allosteric inhibition）。此别构效应剂称为别构抑制剂（allosteric inhibitor）

（三）别构酶的动力学特性不遵守米-曼氏动力学 正协同效应的底物浓度-反应速率曲线为S形曲线 负协同效应的底物-速率曲线外形类似矩形双曲线，但不是矩形双曲线

三、一些调节酶可在催化方向相反的两种酶的作用下发生共价修饰 （一）磷酸化与去磷酸化是最多见的共价修饰方式 共价修饰(covalent modification)或 化学修饰(chemical modification) 酶分子中的某些基团可在其他酶的催化下，共价结合某些化学基团；同时又可在另一种酶的催化下，将此结合上的化学基团去掉，从而影响酶的活性。

酶的共价修饰种类： 1. 磷酸化（phosphorylation） 和去磷酸化（dephosphorylation） 2. 甲基化（methylation） 和去甲基化（demethylation） 3. 腺苷化（adenylation） 和去腺苷化（deadenylation） 4. 尿苷化(uridylation) 和去尿苷化（deuridylation） 磷酸化和去磷酸化修饰是最常见的共价修饰

蛋白激酶 磷蛋白磷酸酶 酶蛋白 酶蛋白 酶的磷酸化与脱磷酸化 ATP ADP Thr Ser Tyr -O-PO32- -OH Thr H2O Pi 磷蛋白磷酸酶 酶的磷酸化与脱磷酸化

（二）共价修饰可引起级联放大效应 在一个连锁反应中，一个酶被磷酸化或去磷酸化激活后，后续的其他酶可同样的依次被其上游的酶共价修饰而激活，引起原始信号的放大，这种多重共价修饰的连锁反应称为级联反应（cascade reaction）。 级联反应的主要作用是产生快速、高效的放大效应。

四、一些酶只有通过对其前体剪切后才有活性 酶原 (zymogen) 有些酶在细胞内合成或初分泌时只是酶的无活性前体，此前体物质称为酶原。 酶原的激活 在一定条件下，酶原向有活性酶转化的过程。

一个或几个特定的肽键断裂，水解掉一个或几个短肽 酶原激活的原理 酶 原 分子构象发生改变 形成或暴露出酶的活性中心 一个或几个特定的肽键断裂，水解掉一个或几个短肽 在特定条件下

肠激酶 胰蛋白酶 甘 异 赖 缬 天 组 丝 S 46 183 活性中心 甘 异 缬 组 丝 S 赖 缬 天 胰蛋白酶原的激活过程

消化蛋白酶原的激活 酶原 激活因子 激活途径 胃蛋白酶原 H+或胃蛋白酶 胃蛋白酶 + 六肽 胰蛋白酶原 肠激酶、胰蛋白酶 胰蛋白酶 + 六肽 胰凝乳蛋白酶原 胰蛋白酶 胰凝乳蛋白酶 + 2个二肽 弹性蛋白酶原 弹性蛋白酶 + 几个肽段 羧基肽酶原 羧基肽酶 + 几个肽段

胰腺 酶原 245 -胰凝乳蛋白酶 245 -胰凝乳蛋白酶  -胰凝乳蛋白酶 245 -胰凝乳蛋白酶  -胰凝乳蛋白酶 胰蛋白酶 1 245 S S S S 胰蛋白酶 -胰凝乳蛋白酶 1 15 16 245 S S S S 194 -胰凝乳蛋白酶 Ser14-Arg15，Thr147-Asn148  -胰凝乳蛋白酶 146 149 245 1 13 16 S S S S -胰凝乳蛋白酶 Ile16转180°Asp194 Met192内表，Gly193伸长 Ser195，His57移位Asp192  -胰凝乳蛋白酶

⊕  -胰凝乳蛋白酶活性中心 His57 CH2 Asp102 C-C=O H2 O H- N N H-O-CH2 Ser195 – Asp102 稳定His57⊕  -胰凝乳蛋白酶活性中心

专一性： -胰凝乳蛋白酶： Leu13-Ser14,Tyr146-Thr147,Asn148-Ala149 -胰凝乳蛋白酶： 芳香族：Phe，Tyr，Trp

酶原激活的生理意义 避免细胞产生的酶对细胞进行自身消化，并使酶在特定的部位和环境中发挥作用，保证体内代谢正常进行。 有的酶原可以视为酶的储存形式。在需要时，酶原适时地转变成有活性的酶，发挥其催化作用。

五、一些结构不同的酶可催化相同的化学反应 （一）同工酶是催化相同化学反应而一级结构不同的一组酶 定义： 同工酶(isoenzyme)是指催化相同的化学反应，而酶蛋白的分子结构、理化性质乃至免疫学性质不同的一组酶。 同工酶主要由于基因倍增（duplication）和趋异（divergence）所致。

* 举例：乳酸脱氢酶(LDH1～ LDH5) H M LDH1 (H4) LDH2 (H3M) LDH3 (H2M2) LDH4 (HM3) 乳酸脱氢酶的同工酶

（二）同工酶在生物体中的分布与表达具有时空特异性 同工酶存在于同一种属的不同个体，同一个体的不同组织、同一细胞的不同亚细胞结构，以及同一组织、细胞的不同发育阶段。 人体各组织器官LDH同工酶谱（活性%） LDH同工酶 红细胞 白细胞 血清 骨骼肌 心肌 肺 肾 肝 脾 LDH1 （H4） 43 12 27.1 73 14 2 10 LDH2 （H3M） 44 49 34.7 24 34 4 25 LDH3（H2M2） 33 20.9 5 3 35 11 LDH4 （HM3） 1 6 11.7 16 27 20 LDH5 （M4） 5.7 79 56

（三）检测组织器官同工酶的变化有重要的临床意义 心肌梗死和肝病病人血清LDH同工酶谱的变化 1 酶活性 心肌梗死酶谱 正常酶谱 肝病酶谱 2 3 4 5 在代谢调节上起着重要的作用； 用于解释发育过程中阶段特有的代谢特征； 同工酶谱的改变有助于对疾病的诊断； 同工酶可以作为遗传标志，用于遗传分析研究。

Catalytic Nucleic Acids 第六节 催化性核酸 Catalytic Nucleic Acids

一、核酶是具有催化活性的RNA 1981年，托马斯.塞克发现 RNA有自身催化作用。 具有催化活性的RNA称为核酶（ribozyme）。 根据核酶的分子大小，可将核酶分为小分子核酶和大分子核酶 。

（一）小分子核酶主要有锤头核酶、发夹核酶 1. 锤头核酶（hammerhead ribozyme） 发现于植物类病毒、拟病毒 A A：顺式催化锤头核酶的二级结构 B：反式催化核酶的二级结构 C：反式催化核酶的三级结构

反式催化的锤头核酶的双螺旋茎I和III是与底物特异结合而形成的互补链。 锤头核酶的组成部分： 由高度保守的核苷酸组成的催化核心（catalytic core） 三个双螺旋茎（I、II和III） 对剪切点的识别序列UH（H为除G以外的核苷酸） 反式催化的锤头核酶的双螺旋茎I和III是与底物特异结合而形成的互补链。

锤头核酶催化转酯化反应的机制 剪切点核苷酸糖基2-OH对邻近的磷酸二酯键进行亲核攻击，产生二个产物，其一含有2, 3-环磷酸。

核酶的催化反应也具有米-曼氏动力学行为 在底物RNA的含量超过核酶含量时，如果核酶每个茎与底物RNA分子形成6个碱基对，其kcat = 12min1，Km = 0.020.2mmol/L。

核酶对RNA的剪切作用 核酶通过与底物RNA的碱基互补形成酶-底物复合物，进而转化成酶-底物过渡态复合物，最后断裂成二个产物。

2. 发夹核酶（hairpin ribozyme） 底物（-5~+9 与核酶结合） （1~50） 来自烟草斑纹病毒卫星RNA、I型菊苣黄色花斑病毒 发夹核酶催化连接反应活性是剪切反应活性的10倍；相反，锤头核酶催化剪切反应的活性是其连接反应活性的100倍。 3. 其他小分子核酶 肝炎病毒核酶(hepatitis delta virus ribozyme) 瓦库德卫星核酶(Varkud Satellite ribozyme, VS ribozyme)

（二）大分子核酶主要有组I内含子、组II内含子和RNA酶P核酶 1. 组I和组II内含子剪接hnRNA 组I内含子（group I intron）和组II内含子（group II intron）发现于细菌和高等植物、真菌和藻类的细胞器中。 这些内含子在hnRNA成熟过程中，进行分子内部的自我剪切去除，并将剩余的外显子连接在一起，形成成熟的mRNA。

2. 核酸酶P核酶是核酸酶P的RNA亚基 核酸酶P是内切核酸酶，催化生成5’成熟的tRNA。 细菌核酸酶P的RNA亚基（称核酸酶P核酶，RNase P ribozyme）具有催化活性，而碱性的蛋白质部分的作用是稳定阴离子的核酸酶P核酶的构象、帮助核酶与底物的结合。

已发现的自然界存在的核酶及其功能 核酶 已鉴定的数量 生物来源 催化反应的类型 组I内含子 >1000 真核生物（细胞核、线粒体、叶绿体）、细菌、噬菌体 自身剪接的转酯化作用（3-OH） 组II内含子 >700 真核生物（细胞器）、细菌 类组I内含子 6 耐格虫属 水解（3-OH） 核酸酶P核酶 >300 真核生物（核、细胞器）、原核生物 锤头核酶 11 植物类病毒和卫星RNA；蝾螈 自身剪切的转酯化作用（2, 3-环磷酸） 发夹核酶 4 植物类病毒和卫星RNA 肝炎病毒核酶 2 人肝炎病毒 VS核酶 1 链孢霉属线粒体 核糖体RNA >5000 真核生物，原核生物 肽转移（肽键） 剪接体RNA >100 真核生物 反式剪接的转酯化作用（3-OH）

二、脱氧核酶是人工合成的具有催化活性的DNA 许多实验室已经合成出一些具有催化活性的DNA分子被称为脱氧核酶（deoxyribozymes）。 主要作用： （1）剪切RNA分子 （2）剪切DNA分子 （3）催化核酸分子磷酸化 （4）连接DNA分子 （5）催化卟啉与金属离子结合

脱氧核酶的构成中含有催化核心和2个底物结合臂，均需二价阳离子（如Mg2+）参与。 8-17特异地剪切AG和GG之间的磷酸二酯键；而10-23则可剪切任何嘌呤-嘧啶之间的磷酸二酯键。 10-23和8-17脱氧核酶的二级结构与酶切位点

三、核酶和脱氧核酶是基因靶向治疗的良好工具 （一）核酶和脱氧核酶应用于抗病毒基因治疗 人工设计的核酶和脱氧核酶可将RNA病毒的基因组作为其剪切的底物，予以破坏。 针对病毒的启动子区域、剪接信号序列或包装信号序列等病毒的保守序列，设计直接剪切这些序列的核酶和脱氧核酶，有效地对抗各种病毒亚型，降低逃逸突变的可能性。

（二）核酶和脱氧核酶可用于肿瘤基因治疗 很多肿瘤起因于体细胞基因功能获得性和功能缺失性变化（变异）。 癌基因的不适当激活可因DNA病毒或反转录病毒感染引起（转化），也可因基因易位引起，基因易位有时还会产生嵌合基因。 抑制癌基因或嵌合基因的表达是当前实施肿瘤基因治疗的策略之一。 核酶和脱氧核酶是值得探讨的策略，因为这种策略理论上可抑制肿瘤细胞而不影响正常细胞。

Research and Application of Enzymes 第七节 酶的研究与应用 Research and Application of Enzymes

一、酶与疾病的发生、临床诊断与治疗密切相关 （一）许多疾病与酶的质和量的异常相关 1．酶的先天性缺陷是先天性疾病的重要病因之一 酪氨酸酶缺乏引起白化病；苯丙氨酸羟化酶缺乏引起苯丙酮酸尿症。 2．酶活性改变可引起疾病 胰腺炎因胰蛋白酶在胰腺中被激活。 3．一些疾病可以引起酶活性的改变 严重肝病时可因肝合成的凝血因子减少而影响血液凝固。

（二）体液中酶的活性可作为某些疾病的诊断指标 组织器官损伤可使其组织特异性的酶释放入血，有助于对此组织器官疾病的诊断。 急性肝炎时，血清中丙氨酸转氨酶活性升高。 2. 恶性肿瘤可因肿瘤组织的增殖加快，其标志酶释放入血增多，有助于对该组织肿瘤的诊断。 前列腺癌病人血清酸性磷酸酶含量增高。 3. 有些酶的清除和排泄障碍也可造成血清含量升高。 肝硬化时血清碱性磷酸酶活性升高。 4. 酶的诱导合成增多也可以从血清中检测出来，用于协助诊断和预后判断。 胆管阻塞时胆汁返流可刺激肝合成碱性磷酸酶增多。

（三）酶与临床治疗有着密切关系 1．酶作为药物用于补充机体某种酶的不足 消化腺分泌功能不良所致的消化不良可服用胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰脂肪酶、胰淀粉酶等予以纠正。 2．利用酶的催化作用对某些疾病进行针对性的治疗 链激酶、尿激酶及纤溶酶等溶解血栓，用于治疗心、脑血管栓塞等。

3．许多化学药物通过抑制或激活体内某种酶的活性对疾病进行治疗 许多抗代谢药是按照对酶的竞争性抑制原理设计的。 4．许多抗菌药物通过抑制细菌的某些酶发挥抑菌作用 青霉素通过阻断细菌细胞壁合成过程中糖肽转肽酶的活性而破坏细菌细胞壁的合成，产生杀菌作用。

二、酶工程是对酶进行改造的新型应用技术 酶工程（enzyme engineering）是利用化学的和基因工程方法对酶的结构、理化性质进行改造，或研发新的酶分子，使之具有更高的催化效率、高度稳定性，更容易提取与纯化，便于工业、农业和医药卫生等领域应用的一门技术。 酶工程方法 化学工程 通过基因重组技术对酶进行修饰、改造或再设计

（一）有些酶可通过化学工程手段进行改造 1．固定化酶是固相酶 固定化酶（immobilized enzyme）是将水溶性酶用物理或化学方法处理，将其固定于有机或无机物的介质上，或包埋于某种膜中，使之成为不溶于水的、稳定的、可以反复使用的固态酶。 固定化酶可以装柱，这样，固定化酶不但具有酶的高催化效率和高特异性，而且还具有类似离子交换层析和亲和层析的优点，反应自动化、连续化、管道化。

2．抗体酶是具有酶活性的抗体 抗体酶（abzyme）是人工制造的具有催化活性的单克隆抗体。 根据酶底物的过渡态与酶的活性中心密切结合并易于生成产物的特性，设计出过渡态分子的类似物，并以此作为抗原，接种于动物体内使之产生相应的抗体。该抗体既然能与过渡态类似物相互适应并结合，也就有可能具有催化过渡态反应的酶活性。这种具有酶活性的抗体，称为抗体酶或催化性抗体（catalytic antibody）。

3．对酶活性中心必需基团的化学修饰可改变酶的催化本质 通过对酶活性中心的某一必需基团的化学修饰，改变酶的催化性质。这种酶即保持酶蛋白的理化性质和稳定性，又可使其具有人们预想的催化目的。

4．模拟酶是人工合成的非蛋白质有机化合物 利用有机合成的方法合成的具有底物结合部位和催化部位的非蛋白质有机化合物称为模拟酶（mimic enzyme）。 模拟酶具有天然酶的高效、特异催化作用。由于模拟酶是小分子的稳定的化合物，应用方便。同时，模拟酶还克服了天然酶提取纯化的复杂性、耗材多、产量低、酶的不稳定性、生物大分子在应用上的抗原性等许多不便。

模拟酶 原理：酶的催化活力是以其活性中心为结构基础的，人工构建的活性中心是否有活力呢？ 基本骨架+活性中心的各基团 具有酶的催化作用 优点：稳定，来源不受限制 缺点：制造难度大，许多酶的催化机制很复杂，还有些未知的。 结合底物 加速反应

胰凝乳蛋白酶的模拟酶 -benzyme Asp102···His57 ···Ser195 COOH 咪唑 OH 环糊精 OH S N NH

（二）酶的基因工程是对酶一级结构的修饰 酶的基因工程是利用重组DNA技术对酶一级结构的修饰，以发现催化活性更高、更稳定的可以大量生产的酶。 酶的基因工程方法 理论性再设计（rational redesign） 直接演化（directed evolution） 在准确了解和掌握酶的结构、功能和催化机制的基础上，采用定点突变改变酶蛋白的氨基酸序列。