有机聚合物毛细管电色谱整体柱的制备及其药物分析中的应用研究 上饶师范学院，化学化工学院 有机聚合物毛细管电色谱整体柱的制备及其药物分析中的应用研究 报告人：陈宗保 单位 ： 上饶师范学院

主要内容 1. 研究背景 2. 目前研究工作进展

研究背景 20世纪五十年代，Mould和Synge首次在簿层色谱中加入电场分离胶棉中糖类化合物. 1981年,Jorgenson和Lukacs的毛细管填充了10 μm 粒径ODS，在电场作用下成功分离了9-甲基蒽和芘，获得了31000 理论塔板数的柱效，具有重要意义。 20世纪90年代，毛细管填充柱制备技术获得突破，大量的液相色谱专家进入CEC研究领域，使毛细管电色谱得到快速发展。 进入21世纪，毛细管电色谱理论与柱制备技术得到篷勃发展。尤其整体柱的制备具有明显的优点，得到广泛的研究与应用。

毛细管电色谱（CEC）原理与特点 CE LC CEC CEC结合了两者优点,具 有两者的双重作用。 高柱效，高选择性，高分离度，快速分离

1.2 毛细管电色谱整体柱的分类 在毛细管内，通过原位聚合或固化的方法制备得到具有多孔结构的连续棒状整体 。 材质性质 分离模式 具有制备简单、取材广泛、多种化学修饰及pH使用范围宽等优点。 分离模式

1.4 毛细管电色谱整体柱的应用研究 生命科学分析 药物分析 环境分析 食品分析 工业分析

研究内容： 1 疏水性(LMA-co-EDMA)毛细管有机聚合物整体柱的制备及其分离性能研究 2 聚(SMA-TRIMA) 毛细管电色谱整体柱的制备及其分离核苷及嘌呤类化合物 3 亲水性毛细管电色谱整体柱的制备及其分离生物碱的研究

1.LMA-co-EDMA的制备 1.1 毛细管处理及硅烷化 图1-1 毛细管预处理的步骤 图1-2毛细管硅烷化反应示意图

引发剂(AIBN)(g)/AMPS(g) 1.2 制备的优化 表2-1 致孔剂含量影响整体柱的制备 单体（LMA）/交联剂（EDMA） 引发剂(AIBN)(g)/AMPS(g) 致孔剂含量 300 µL/200 µL 5.0 mg/ 2.0 mg 500 µL 600 µL 750 µL 900 µL 1000 µL 表2-2 致孔剂组分间的配比影响整体柱的制备 Column Porogen mixture Cyclohexanol (%) 1, 4-butanediol (%) Water (%) 1 75 15 10 2 70 20 3 65 25 4 60 30 5 55 35 6 50 40

(a) 2h, (b) 5h, (c)10h, (d) 12h, (e) 15h, (f) 20h (a) (b) (c) (d) (e) (f) 图2-3 不同反应时间制备整体柱的SEM图 (a) 2h, (b) 5h, (c)10h, (d) 12h, (e) 15h, (f) 20h

图2-4 最佳条件下制备的整体柱不同截面的SEM图 1.3 整体的性能评价 1.3.1 整体柱形貌 图2-4 最佳条件下制备的整体柱不同截面的SEM图 (a) 800, (b) 3000, (c) 5000

图1-3 不同比例乙腈/ pH 7.0 10 mmol/L 磷酸盐缓冲溶液(v/v) 1.3.2 分离性能评价 1.3.2.1 电渗流 pH考查: 随着pH值从2.5升至3.0，EOF速度从0.88 mm/s增大到1.15 mm/s，当pH>3.0后，EOF速度随pH值的增大基本上保持不变 图1-3 不同比例乙腈/ pH 7.0 10 mmol/L 磷酸盐缓冲溶液(v/v)

1.3.2.2 分离机理研究 表2-3 乙腈的含量对保留因子的影响 k* ACN (%) k*rutin k*quercitrin 实验选择芦丁、槲皮甘、槲皮素、山柰酚四种黄酮类化合物进行分离分析，考察了各种影响分离分析的因素，对四种黄酮类化合物在整体柱上的保留行为进行探讨. 表2-3 乙腈的含量对保留因子的影响 k* ACN (%) k*rutin k*quercitrin k*quercetin k*kaempferol 25 1.31 1.49 1.70 1.90 45 1.01 1.20 1.33 1.41 60 0.84 0.97 1.14 1.21 70 0.54 0.80 0.96 1.06 80 0.43 0.63 0.66 0.87 图2-6 四种黄酮类化合物的结构式

图2-7 四种黄酮化合物电色谱图

1.4 整体柱的应用研究 1.4.1 分离条件的优化 在线富集-CEC方法测定人体尿液中三种β2激动剂, 并优化各种分离条件及在线富集方法。实验考察了乙腈比例、缓冲液的pH对三种β2激动剂分离效果的影响。 图2-8 不同乙腈含量对分析物保留的影响 图2-9 缓冲溶液pH对分离的影响

1.4.2 富集技术的优化 36倍 320倍 45倍 图2-10 三种β2激动剂的结构式 1. 沙丁胺醇，2. 丙卡特罗，3. 福莫特罗 图2-12 进样电压与进样时间对富集效果的影响 320倍 45倍 图2-11 样品基质对富集效果的影响

表2-4 回归方程、相关系数、线性范围、检测限及重现性 1.4.3 方法评价 表2-4 回归方程、相关系数、线性范围、检测限及重现性 β2-agonists Calibration function LOD (μg/mL) RSD% (n=5) Regression equation Correlation coefficient Linear range S/N=3 Retention time Peak area salbutamol y=45.23x+44.48 0.9973 0.25-10.0 0.08 0.56 3.6 procaterol y=30.28x-0.7072 0.9915 0.10-5.0 0.84 6.4 formoterol y=46.11x+62.78 0.9910 0.01 0.47

图2-13 志愿者口服沙丁胺醇药片前后尿样电色谱图（a）空白尿样(口服后0 h);（b）实际尿样(口服后2 h); 1.4.4 实际样品分析与回收率实验 表2-5 三种β2激动剂的加标回收率 β2agonists Added(μg/mL) Found(μg/mL) Recovery (%) RSD (%) (n=3) salbutamol 5.0 5.44 108.8 6.7 1.0 1.09 109.1 8.2 procaterol 2.5 2.64 105.4 8.9 0.5 0.51 101.2 7.4 formoterol 2.06 82.4 0.45 89.1 9.9 图2-13 志愿者口服沙丁胺醇药片前后尿样电色谱图（a）空白尿样(口服后0 h);（b）实际尿样(口服后2 h);

图2-1 聚(SMA-co-TMPTMA)整体柱孔结构及管壁截面电镜图 整体柱最佳配比：功能单体：SMA/TMPTMA=3/2（v/v）; 致孔剂(环己醇/1,4-丁二醇/水=66.7/23.3/10)：功能单体=6/4; 引发剂(AIBN)(g)/AMPS(g)/功能单体(mL)=4.0/1.2/100(w/w/v); 图2-1 聚(SMA-co-TMPTMA)整体柱孔结构及管壁截面电镜图 图2-2 影响电渗流的因素

图2-3 1 胞苷; 2 腺苷; 3 N6 -甲基腺苷; 4 腺嘌呤; 5 鸟嘌呤 2.3 整体柱应用研究 图2-3 1 胞苷; 2 腺苷; 3 N6 -甲基腺苷; 4 腺嘌呤; 5 鸟嘌呤

2.3.1 核苷类化合物分离条件的优化 图2-4 进样时间对分离的影响 图2-5 有机调节剂对分离的影响 图2-4 进样时间对分离的影响 图2-5 有机调节剂对分离的影响 Peak: 1 adenine, 2 guanine, 3 N6- methyladenosine, 4 adenosine, 5 cytidine

图2-6 pH对分离的影响 图2-7 缓冲溶液浓度的影响 Peak: 1 adenine, 2 guanine, 3 N6- methyladenosine, 4 adenosine, 5 cytidine

图2-9 最佳色谱条件下核苷类化合物的电色谱图 detection wavelength, 210 nm CEC conditions: mobile phase, pH 5.5, 6.0 mmol/L broax buffer; applied voltage, 15 kV; sample injection, 10 kV/5 s； detection wavelength, 210 nm 图2-8 电压对分离的影响 Peak: 1 adenine, 2 guanine, 3 N6- methyladenosine, 4 adenosine, 5 cytidine

2.3.2 方法线性范围及检测限 Compound Regression equation R2 Line range （μg/mL） 2.3.2 方法线性范围及检测限 表3-3 回归方程、相关系数、线性范围和检测限 Compound Regression equation R2 Line range （μg/mL） Detection limit (μg/mL) Adenine y=1.3432x+4.7659 0.9949 0.5~50.0 0.50 Guanine y=0.9735x+2.2248 0.9934 1.0~100.0 0.20 N6-Methyladenosine y=1.2132x+3.1323 0.9987 Adenosine y=1.3486x+4.1372 0.9921 0.25 Cytidine y=0.8764x+4.3532 0.9917

2.3.3 空白尿样回收率实验 表3-4 核苷类化合物的回收率(n=3) Compound Added (μg/mL) Found Recovery (%) RSD（n=3） Adenine 10.0 9.55 95.50 3.63 30.0 28.1 93.67 2.12 Guanine 10.53 105.3 4.21 50.0 49.85 99.70 3.38 N6-Methyladenosine 8.97 89.70 2.28 51.35 102.7 3.75 Adenosine 11.33 113.3 4.38 48.74 97.48 4.76 Cytidine 8.89 88.90 3.73 51.76 103.5 4.25

致孔剂甲苯(µL)/环己醇（µL）/十二醇(µL) 4.1 整体柱制备 3.1 亲水性整体柱的制备 表4-1 致孔剂组分间的比例优化 AM(mg)/GMA(µL)/ MBAA（mg）/溶解液(µL) AIBN)(g)/AMPS（g） 致孔剂甲苯(µL)/环己醇（µL）/十二醇(µL) 20/80/50/200 2.0/4.0 30/0/370 30/30/340 30/50/320 20/80/50200 30/70/300 30/100/270 图4-1 功能单体与交联剂的结构式

图4-2 整体柱的电镜图(a)1000×; (b) 3000×;(c) 5000× 3.2 整体柱的形貌 (b) (a) (c) 图4-2 整体柱的电镜图(a)1000×; (b) 3000×;(c) 5000×

3.3 整体柱分离性能评价 3.3.1 有机相比例的影响 图4-3不同比例的有机相（40%，45%，47.5%，50%，55%）的色谱图. 1 aniline, 2 naphthylamine，3 diphenylamine，4 DMA，5 thiourea

1 aniline, 2 naphthylamine，3 diphenylamine，4 DMA，5 thiourea

1 aniline, 2 naphthylamine，3 diphenylamine，4 DMA，5 thiourea 3.3.3 运行电压的影响 图4-5 不同运行电压（5.0，10，15，20）的色谱图. 1 aniline, 2 naphthylamine，3 diphenylamine，4 DMA，5 thiourea

3.5 整体柱的应用研究 3.5.1ACN含量的影响 图4-6 五种生物碱的结构式 图4-7不同比例的有机相（70%，65%，60%，55%）的色谱图. 1 piperine; 2，nuciferine; 3 kokuline; 4berberine; 5 Tetrandrine

图4-9不同比例的分离电压（18，15，12，10）的色谱图. 3.5.2 pH的选择 3.5.3 分离电压的选择 图4-9不同比例的分离电压（18，15，12，10）的色谱图. 图4-8不同比例的pH（5.5，6.8，8.5）的色谱图.

3.5.4 方法线性范围及检测限 analysts Calibration function LOD(μg/mL) RSD% (n=5) 表4-2 线性方程、相关系数、检测限及精确度 analysts Calibration function LOD(μg/mL) RSD% (n=5) Regression equationa) r Linear range (μg/mL) S/N=3 Retention time Peak area piperine y=7.137x-1.2896 0.9974 0.50-5.00 0.02 0.56 3.6 nuciferine y=18.28x-0.4280 0.9971 0.05 0.84 6.4 kokuline y=10.578x+7.098 0.9981 0.1 0.65 7.3 berberine y=46.94x-39.312 0.9918 0.74 5.1 Tetrandrine y=16.394x+2.536 0.9952 0.47

3.5.5 回收率实验 3.5.6 实际样品分析 analysts Added(μg/mL) Founded(μg/mL) Recovery (%) RSD (%) piperine 1.0, 0.5 0.97, 0.467 97.0, 93.4 6.7, 8.2 nuciferine 2.5, 1.0 2.5, 1.08 100.0, 108.0 6.5, 7.1 kokuline 2.47, 0.963 99.1, 96.3 5.6, 6.7 berberine 2.64, 0.98 105.6, 98.0 8.9, 7.4 Tetrandrine 2.46, 1.02 98.4, 102 7.3 9.2 图4-10小檗碱药片样品图 图4-11尿样品图

Thank you!