RNA干扰抑制CD147表达对人胃癌细胞SGC7901增殖、侵袭和顺铂敏感性的影响 王书奎 MD, PhD 南京医科大学附属南京第一医院 2010.5.18 1 1

报告内容 研究背景 研究目标 实验方法与结果 实验结论

一、 研究背景

胃癌概况 胃癌最常见的恶性肿瘤之一，恶性肿瘤致死占第二位 。其恶性程度较高，转移扩散严重，多数患者就诊时已属中晚期，因而死亡率较高 。

MMP简介 肿瘤的侵袭和转移是一个复杂的过程，其中细胞外基质和基底膜的降解是肿瘤转移过程中的重要步骤。这与细胞外基质金属蛋白酶（extracellular matrix metalloproteinase，MMP）的参与密不可分。

MMP是一个锌离子依赖的蛋白酶家族，目前已发现26种。MMP的主要功能是降解细胞外基质。肿瘤细胞利用MMP的基质降解能力迁移到其他部位。在肿瘤与间质交界处，MMP往往高表达 。

20世纪80年代，Biswas实验室从人肺癌细胞株LX-1的细胞膜上分离得到了一种58 kDa的糖蛋白，具有刺激成纤维细胞合成MMP-1的功能，将其命名为肿瘤胶原酶刺激因子（tumor collagenase stimulating factor，TCSF）。

进一步研究表明TCSF不仅能刺激MMP-1的产生，还能刺激MMP-2、MMP-3、MMP-9和MMP-11等的产生，因此将其重命名为细胞外基质金属酶诱导因子（extracellular matrix metalloproteinase inducer，EMMPRIN)。 第六届人类白细胞分化抗原协作组会议将EMMPRIN命名为CD147。

CD147的结构 CD147属单次跨膜糖蛋白，胞外段中的4个半胱氨酸残基形成2个二硫键，构成2个典型的半球形Ig结构域。

细胞内的CD147存在低糖基化（ low glycosylated CD147， LG）和高糖基化（high glycosylated CD147，HG）形式，分子量分别是32~44kDa、45~65kDa。只有HG形式能刺激MMP的产生。

CD147的功能 CD147是一种广泛表达于细胞表面，在体内分布广泛，参与精子发生、胚胎发育、肿瘤的侵袭和转移、炎症反应、病毒感染等多种生理和病理过程，是一个多功能的分子。

免疫组化实验证实CD147在多种恶性肿瘤中高表达，包括膀胱癌、皮肤癌、肺癌、乳腺癌、淋巴癌和胰腺癌等。并且肿瘤的恶性程度越高，CD147的表达水平也越高。

CD147就是通过刺激成纤维细胞及肿瘤细胞本身产生多种MMP来降解基底膜和细胞外基质，从而促进肿瘤的浸润和转移的。 1. 促进肿瘤的侵袭和转移 CD147就是通过刺激成纤维细胞及肿瘤细胞本身产生多种MMP来降解基底膜和细胞外基质，从而促进肿瘤的浸润和转移的。

2. 诱导肿瘤血管生成 血管内皮生长因子（vascular endothelial growth  factor ， VEGF）是很多情况下血管生成过程的主要调节因子，包括肿瘤形成过程 。CD147可以诱导VEGF的表达。

3. 促进肿瘤细胞多药耐药 在多种多药耐药的肿瘤细胞中都观察到CD147的高表达。CD147可激活PI3K/AKT细胞存活信号通路。在大多数恶性肿瘤细胞中此通路均被激活。

胃癌中CD147的表达 日本Toyama大学的Zheng HC等研究表明：在正常胃黏膜发展为增生性或化生性胃黏膜，最后发展为胃癌的过程中，CD147的表达量是逐渐增加的，并且CD147的表达与肿瘤大小、浸润深度、淋巴结转移以及MMP-2、MMP-9和VEGF的表达呈正相关。

胃癌组织中CD147的表达 CD147在胃癌组织中高表达

二. 研究目标

本实验旨在运用RNA干扰技术抑制胃癌细胞株SGC7901中CD147基因的表达，研究该基因沉默后对肿瘤细胞生长、侵袭能力及化疗药物敏感性的影响，探讨CD147在胃癌中的作用。

三、研究方法及结果

技 术 路 线 CD147shRNA真核表达载体的构建与鉴定 ↓ 转染SGC7901细胞，筛选稳定表达干扰载体的SGC7901细胞株 MTT法检测SGC7901细胞增殖水平的变化 明胶酶谱法检测SGC7901细胞MMP-2、MMP-9分泌的变化 SGC7901细胞体外侵袭力测定 MTT检测SGC7901细胞顺铂敏感性的变化 技术路线 技 术 路 线

胃癌细胞株SGC7901源自一位56岁女性胃腺癌患者的淋巴结转移瘤。研究表明其侵袭能力强，恶性程度高。我们前期研究表明，该细胞表面CD147是高表达的。

shRNA（short hairpin RNA）表达载体的构建 pSilencer3.1-H1 neo

shRNA模板的设计示意图

干扰靶序列的选择 参考陈翔等的报道，选取CD147mRNA 370-390和808-828作为靶序列，相应的shRNA分别命名为shRNA1和shRNA2。另外，设计一个阴性对照shRNA-control。

RNAi靶序列在CD147 mRNA上的位置 1 AGCGGTTGGA GGTTGTAGGA CCGGCGAGGA ATAGGAATCA TGGCGGCTGC 51 GCTGTTCGTG CTGCTGGGAT TCGCGCTGCT GGGCACCCAC GGAGCCTCCG 101 GGGCTGCCGG CACAGTCTTC ACTACCGTAG AAGACCTTGG CTCCAAGATA 151 CTCCTCACCT GCTCCTTGAA TGACAGCGCC ACAGAGGTCA CAGGGCACCG 201 CTGGCTGAAG GGGGGCGTGG TGCTGAAGGA GGACGCGCTG CCCGGCCAGA 251 AAACGGAGTT CAAGGTGGAC TCCGACGACC AGTGGGGAGA GTACTCCTGC 301 GTCTTCCTCC CCGAGCCCAT GGGCACGGCC AACATCCAGC TCCACGGGCC 351 TCCCAGAGTG AAGGCTGTGA AGTCGTCAGA ACACATCAAC GAGGGGGAGA 401 CGGCCATGCT GGTCTGCAAG TCAGAGTCCG TGCCACCTGT CACTGACTGG 451 GCCTGGTACA AGATCACTGA CTCTGAGGAC AAGGCCCTCA TGAACGGCTC 501 CGAGAGCAGG TTCTTCGTGA GTTCCTCGCA GGGCCGGTCA GAGCTACACA 551 TTGAGAACCT GAACATGGAG GCCGACCCCG GCCAGTACCG GTGCAACGGC 601 ACCAGCTCCA AGGGCTCCGA CCAGGCCATC ATCACGCTCC GCGTGCGCAG 651 CCACCTGGCC GCCCTCTGGC CCCTCCTGGG CATCGTGGCT GAGGTGCTGG 701 TGCTGGTCAC CATCATCTTC ATCTACGAGA AGCGCCGGAA GCCCGAGGAC 751 GTCCTGGATG ATGACGACGC CGGCTCTGCA CCCCTGAAGA GCAGCGGGCA 801 GCACCAGAAT GACAAAGGCA AGAACGTCCG CCAGAGGAAC TCTTCCTGAG 851 GCAGGTGGCC CGAGGACGCT CCCTGCTCCA CGTCTGCGCC GCCGCCGGAG 901 TCCACTCCCA GTGCTTGCAA GATTCCAAGT TCTCACCTCT TAAAGAAAAC 951 CCACCCCGTA GATTCCCATC AT

设计好的shRNA插入序列 shRNA1 5'-GATCCGTCGTCAGAACACATCAACTTCAAGAGAGTTGATGTGTTCTGACGACTTTTTTGGAAA-3’ 5'-AGCTTTTCCAAAAAAGTCGTCAGAACACATCAACTCTCTTGAAGTTGATGTGTTCTGACGACG-3' shRNA2 5'GATCCGTGACAAAGGCAAGAACGTCTTCAAGAGAGACGTTCTTGCCTTTGTCATTTTTTGGAAA-3’ 5'AGCTTTTCCAAAAAATGACAAAGGCAAGAACGTCTCTCTTGAAGACGTTCTTGCCTTTGTCACG-3’ shRNA-control 5‘GATCCACTACCGTTGTTATAGGTGTTCAAGAGACACCTATAACAACGGTAGTTTTTTTGGAAA-3' 5'AGCTTTTCCAAAAAAACTACCGTTGTTATAGGTGTCTCTTGAACACCTATAACAACGGTAGTG-3’

2、CD147 shRNA表达载体的构建： 将合成的三对片段分别用水浴中加热后退火备用，与经BamH I和Hind III双酶切的pSilencer3.1-neo质粒连接，构建成CD147 shRNA表达载体，重组质粒分别命名为pSilencer-shRNA1， pSilencer-shRNA2 和pSilencer-shRNA-control 。

重组质粒测序鉴定结果 pSilencer/shRNA1测序图（红线为插入片段） DNA测序表明，3个重组质粒构建正确。

转染及筛选 脂质体转染48h后用含0.4μg/ml的G418的完全培养基筛选2周，然后改为半量维持。将抗G418的阳性细胞克隆用有限稀释法分离出来并逐步扩增以待进一步分析。筛选出的细胞克隆分别命名为SGC7901/shRNA1，SGC7901/shRNA2和SGC7901/shRNA-control。

Real-time PCR检测CD147 mRNA表达水平 与SGC7901相比，SGC7901/shRNA1和SGC7901/shRNA2细胞中CD147 mRNA相对表达量分别下降至72.4%和17.3% 。

HG代表高糖基化形式的CD147，LG代表低糖基化形式的CD147。Western blot结果与Real-time PCR结果相符。 1 2 3 4 HG LG CD147 β-actin Lane 1: SGC7901. Lane 2: SGC7901/shRNA-control Lane 3: SGC7901/shRNA1 Lane 4: SGC7901/shRNA2 HG代表高糖基化形式的CD147，LG代表低糖基化形式的CD147。Western blot结果与Real-time PCR结果相符。

抑制率(%)=(对照组A 值-实验组A 值)／对照组A 值×100% MTT细胞增殖实验 接种细胞 培养细胞 加入MTT呈色 24h、48h、72h 时间点 终止培养 比色 结果计算 抑制率(%)=(对照组A 值-实验组A 值)／对照组A 值×100%

与SGC7901和SGC7901/shRNA-control相比，培养24h、48h、72h后SGC7901/shRNA2细胞增殖能力均显著降低.而阴性对照组SGC7901/shRNA-control增殖能力无显著改变。

明胶酶谱法检测细胞上清中MMP-2和MMP-9的活性 明胶酶包括72 kDa的明胶酶A（基质金属蛋白酶-2，MMP-2）和92 kDa的明胶酶B (基质金属蛋白酶-9，MMP-9)。其作用底物为基底膜中的Ⅳ型胶原和变性的间质胶原（明胶），其活性与肿瘤细胞侵袭和转移能力密切相关。

明胶酶谱法是一种测定明胶酶活性的常用方法。收集细胞培养上清液，用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法可将这两种明胶酶按分子量大小分开，显示两条负染条带，根据条带的面积和亮度可判定明胶酶的活性。

明胶酶谱结果 1 2 3 MMP-9 MMP-2 SGC7901/shRNA2细胞上清液中MMP-2和MMP-9的活性明显降低 * B MMP-2 MMP-9 1 2 3 Lane 1:SGC7901. Lane 2:SGC7901/shRNA-control. Lane 3:SGC7901/shRNA2 SGC7901/shRNA2细胞上清液中MMP-2和MMP-9的活性明显降低

Transwell原理 Matrigel是从小鼠EHS肉瘤中提取的基质成分，含有层粘连蛋白、Ⅳ型胶原等。将Matrigel铺在Transwell侵袭小室的多孔滤膜上，能形成与天然基底膜极为相似的基底膜结构。

穿过Transfer侵袭小室的染成紫色的细胞（×400） Transwell结果 SGC7901 SGC7901/shRNA-control SGC7901/shRNA2 穿过Transfer侵袭小室的染成紫色的细胞（×400）

SGC7901/shRNA2细胞 体外侵袭能力显著降低 B * SGC7901/shRNA2细胞 体外侵袭能力显著降低

顺铂敏感性实验 抗肿瘤药物顺铂的使用浓度以血浆峰浓度（ Peak Plasma Concentration，PPC) 为标准。参照Sondak等的报道，顺铂的PPC为3.0 μg/ml。 本实验中使用的顺铂浓度为：0.01PPC，0.1PPC，10PPC。细胞生长抑制率（%）=[1-OD(cisplatin＋）/OD(cisplatin－)] ×100%

与SGC7901和SGC7901/shRNA-control相比，顺铂对SGC7901/shRNA2的抑制率显著增加 * 与SGC7901和SGC7901/shRNA-control相比，顺铂对SGC7901/shRNA2的抑制率显著增加

四、实验结论

成功构建了靶向CD147的shRNA真核表达载体； 成功转染了人胃癌细胞SGC7901，并获得了稳转细胞株，经Real-time PCR、Western Blot检测，CD147在mRNA和蛋白水平均被显著抑制； CD147表达沉默后SGC7901的增殖能力明显降低，细胞的MMP-2和MMP-9的活性明显降低，细胞的体外侵袭能力明显降低，细胞对化疗药物顺铂的敏感性增强。

我们的研究表明：CD147在胃癌细胞SGC7901增殖、侵袭和化疗药物敏感性中发挥重要作用；CD147可能是胃癌治疗的一个有效的靶点。

下一步的研究方向 1.动物水平的实验（裸鼠移植瘤模型，体内肿瘤细胞 侵袭实验）； 2.CD147自身的表达调控；

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