Agilent 1100 纯化系统

制备液相的操作 分析型液相与制备型液相的区别 （半）制备液相方法的建立 制备液相操作技巧及注意事项 Agilent 1100 样品纯化解决方案介绍 Agilent Restricted

HPLC术语 > 5 mL/min 5~10 mm 半制备液相色谱 1.5 ~ 5 mL/min 3~5 mm 常规液相色谱 小口径（窄口径）液相色谱 100 ~ 500 µL/min 1 ~2 mm 微孔液相色谱 1 ~100 µL/min 0.1~ 1mm 毛细管液相色谱 < 50 nL/min < 20 µm 开管液相色谱(纳流液相色谱) 典型流速 柱内径 种类 > 10 mL/min > 10mm 制备液相色谱 Agilent Restricted

高压制备与中/常压制备的比较 高压制备 中/常压制备 可使用与分析柱相同的细粒径填料，柱效高，组分分离度高； 分离重现性好； 节约分析时间及成本。 中/常压制备 只能使用较粗的填料，柱效低，对组分的分离度有限； 分离影响因素多（柱装填的均匀性，柱效，填料质量，流量稳定性及准确性等）； 时间消耗多。 Agilent Restricted

分析液相与制备液相的比较 制备型液相 分析型液相 目的: 组分的分离纯化 半制备液相 流速较低 (< 10 ml/min) 柱内径较小 (< 10 mm) 制备液相 高流速 (> 10 ml/min) 柱内径大 (> 10 mm) 系统管线（0.5mm, I.d) 低流速将导致更大的扩散 流通池光程 (3、0.3 或 0.06 mm) 避免检测器的饱和，灵敏度降低，便于增加进样量 分析型液相 目的: 组分的定性定量 低流速 (< 2 ml/min) 色谱柱内径小 (< 5 mm) 系统管路 (0.12～0.17 mm I.d) 流通池光程 (5~10 mm) The question, Can I do method development (analytical scale) and preparative scale on the same system? This slide is meant to show you that there are physical limitations with the preparative system that when operating at very low flow rates, amoung other things, you will have greater dispersion compared to a “true” analytical system. So, the answer to this question is really dependent on the customer application, their sample matrix - the more complex it is the more difficult it will be to achieve baseline separation, etc.. The next few slides will demonstrate performance at 1.5 ml/min with the preparative scale system (larger bore tubing) using both a quaternary and prep pump. In the coming months we will have a more detailed technical note. Agilent Restricted

纯化过程 N Y 复杂样品纯化 溶剂提取 结晶 常压和/或中压色谱分离 不同的组分群 高压制备分离纯化 目标组分达到一定含量及纯度要求 Agilent Restricted

液相制备的工作步骤 优化分析方法: 1 对目标制备组分的分离度控制在 1.5～3之间 分离度 1.5 ~ 3 min 5 10 15 20 25 30 mAU 50 100 150 200 250 300 分离度 1.5 ~ 3 Agilent Restricted

2 在分析柱上进行过载试验 Vinj 样品分析 体积过载 浓度过载 色谱柱的过载 Agilent Restricted

分析柱上的过载试验 进样量 500 µg each 250 µg each 25 µg each 2.5 µg each mAU 1000 2000 3000 4000 5000 进样量 500 µg each 250 µg each 25 µg each 2.5 µg each 0.25 µg each 0.025 µg each 2 4 6 8 10 12 14 min Agilent Restricted

 制备放大的计算 分析柱： Zorbax SB-C18 3x150 mm, 5 µm 流速: 0.6 ml/min 进样量: 500 µg 制备柱: Zorbax SB-C18 21.2x150 mm, 5 µm 流速: ~30 ml/min 进样量:25 mg CL = 柱长比 = 1 V1 = 分析柱的流速= 0.6 ml/min x1 = 分析柱最大上样量= 500 µg r1 = 分析柱内径= 1.5 mm V2 = 制备柱的流速＝？ x2 = 制备柱最大上样量=? r2 = 制备柱内径=10.6mm Agilent Restricted

 制备放大试验 min 2 4 6 8 10 mAU 500 1000 1500 2000 Agilent Restricted

影响硅胶填料反相色谱柱性能的参数 因此，并非所有C18柱都相同， 分析柱和制备柱应选择相同的填料！！ 硅胶类型： 不定形硅胶，球形硅胶 柱容量，充填均匀度 硅胶纯度： 金属含量，填料酸性 峰形 填料颗粒尺寸：粒径大小分布，均匀度 充填均匀度，流速相关性 填料孔径： 7～12nm，30nm 适用的化合物分子量范围 键合密度： 含碳量 容量因子，保留时间 键合方式： 键合相修饰 选择性，水性流动相的耐受性 柱填料量： 柱床实密性 柱容量 封端技术： 屏蔽硅醇基， 碱性化合物的峰形，选择性 消除二次化学平衡效应 因此，并非所有C18柱都相同， 分析柱和制备柱应选择相同的填料！！

浓度，体积，样品溶解性能，组分含量，回收率，柱容量 制备参数的关系 10 min 产量：进样量， 组分收集参数设定 浓度，体积，样品溶解性能，组分含量，回收率，柱容量 产量 纯度 通量 30 min 纯度：分离度 柱效，进样量，分离条件 6 min 通量：分析时间 分离条件，样品复杂程度 Agilent Restricted

制备产率 产量＝样品浓度进样体积组分含量收集回收率累积次数 样品浓度：化合物的溶解性能（溶剂、温度、样品纯度等） 进样体积：柱容量，流通池设计 收集回收率：分离条件，组分收集触发参数的设定 累积次数：分析时间，容器的容量 可使用3.0~50mm内径的色谱柱，分析和制备在同一套系统上完成，便于方法的建立和转换；每次进样“产量”与多种因素相关，用户可通过多次进样，以及累积收集功能，获得纯度及产率满意的纯化合物。 Agilent Restricted

Vdelay=Vmixer+Vpre-column 梯度延迟体积 建议：测定不同系统的延迟体积，并通过调节梯度的起始时间，以便在不同仪器上获得重现的色谱图 Vdelay=Vmixer+Vpre-column min 5 10 15 20 25 200 400 600 800 1000 mAU 梯度起点 高压混合梯度 低压混合梯度 滞后时间 延迟体积：二元泵 400uL 四元泵 1000uL

因此，在不同系统之间进行方法转换，需分别测定系统延迟体积 柱前延迟体积的影响 min 2 4 6 8 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 梯度曲线 3 5 1100 制备泵 因此，在不同系统之间进行方法转换，需分别测定系统延迟体积 min 2 4 6 8 200 400 600 800 1000 1200 相对延迟 3 其它制备泵 梯度曲线 This is a separation done under the same conditions on both systems and you see how long it can take for the compounds elute. Agilent Restricted

柱后延迟体积对自动组分收集的影响 UV检测器 MS检测器 组分收集器 由于管线连接的不同长度，流分到达组分收集器的时间将与信号被检测的时间（保留时间）存在不同的滞后，如果根据保留时间收集将导致组分收集的错误甚至缺失，因此，进行延迟体积的校正是非常必要的。 Agilent Restricted

延迟体积的自动计算及校正 Calc Delay Vol. 384L Agilent Restricted

检测波长影响 严重干扰组分纯度及产率 波长选择不当 分离度 组分交叉收集 254nm 205nm Agilent Restricted min 1 2 3 4 5 6 mAU 500 1000 1500 2000 2500 4.244 4.800 254nm 3.276 4.242 4.820 205nm 严重干扰组分纯度及产率 波长选择不当 分离度 组分交叉收集 Agilent Restricted

用户应用实例 分析进样量：1.5mg 分析柱：Zorbax XDB C18 4.6250mm 进样量：10mg/mL150 L min 2 4 6 8 10 mAU 500 1000 1500 2000 2500 6.423 7.168 Inj. 10mg/mL, 150uL 分析柱：Zorbax XDB C18 4.6250mm 进样量：10mg/mL150 L 理论计算 制备进样量：20mg 或相同浓度进样体积：2mL min 1 2 3 4 5 6 mAU 500 1000 1500 2000 2500 4.244 4.800 254nm 制备柱：Zorbax XDB C18 21.2150mm 进样量：40mg/mL400 L 溶解度及进样体积限制 每次进样16mg Agilent Restricted

样品纯化技巧以及注意事项 尽量采用浓度过载方式上样：有利于防止因样品在柱头扩散而降低柱效； 所有连接管线，尤其柱后管线尽可能短，避免不必要的峰扩散，影响收集效率； 采用装填细粒径填料的制备柱（7m或5m ），保证良好的柱效，高分离效能，缩短分析时间； 准确设定组分收集的触发参数，避免因收集位点的偏移影响组分纯度及产率； 采用高质量的溶剂作为流动相：防止溶剂中带入不可知的杂质； 注意所有容器的洁净度，防止不可预知的杂质污染。 Agilent Restricted