实验六 细胞核和线粒体的荧光观察
一、实验目的 学习荧光显微镜的工作原理及使用方法 了解荧光探针Rhodamine 123 和Hoechst33342 与细胞成分的结合特性和光谱特性
二、实验原理 1.荧光显微镜
常用荧光探针介绍 细胞参量 荧光探针 吸收/发射 nm 特性 DNA和RNA 蛋白和抗体的耦联探针 溶酶体 线粒体 Propidum iodide(PI) 535/617 红色荧光 嵌入核酸双链间,只能标记死细胞.用于 染色体,细胞观察,分辨死活细胞和细胞周期研究 Ethidium bromide(EB)518/605 红色荧光 嵌入核酸双链间,只能标记死细胞.用于电泳分析,染色体观察 DAPI 358/461 蓝色荧光 半通透细胞,结合于DNA的AT碱基对.用于细胞周期的研究,染色体和细胞核的观察 Hoechst33342 350/461 蓝色荧光 结合于DNA的AT碱基对,可进入活细胞,用于细胞周期的研究,染色体和细胞核的观察 蛋白和抗体的耦联探针 FITC 494/518 绿色荧光 染死细胞,对PH值变化不敏感 Texas red 595/615 红色荧光 多参量细胞标记 溶酶体 Neutral red 541/640 红色荧光 探针微偏碱性,可标记溶酶体等酸性细胞器 线粒体 Rhodamine 123 507/529 黄绿色荧光 可进入活细胞,阳离子性,摄入快,淬灭快,无毒性
Hoechst33342和Rhodamine 123 Ho.33342是一种亲脂性物质，能与DNA特异性结合的荧光探针，所以被大量用于活细胞的观察和定量的研究。荧光激发和发射特性分别为350nm和461nm。 罗丹明123是一种亲脂性的阳离子荧光探针。用它来标记线粒体是由于线粒体的基质对于膜间隙具有负电荷，而罗丹明123具有正电荷，二者电性相吸。所以能较好地观察线粒体的形态变化。荧光激发和发射特性为507nm和529nm。
三、仪器、材料与试剂 仪器 荧光显微镜，倒置显微镜 材料 A549、WI-38 pc-3、载玻片，盖片，滴管，滤纸 试剂 PBS缓冲液pH7.4 Ho.33342储存液:1mg/mL(溶于PBS) 罗丹明123储存液: 1mg/mL(溶于甲醇)
四、实验步骤 1.将肿瘤细胞和正常组织细胞培养到小盖玻片上 2.配制Ho.33342和罗丹明123 工作液:Ho.33342 (10μg/mL), 罗丹明123(10μg/mL)（溶于PBS缓冲液，pH7.4） 3.将盖玻片上的细胞用PBS缓冲液轻轻漂洗2次 4.在parafilm 膜上分别滴加Ho.33342和罗丹明123工作液各10L，将盖玻片上的细胞倒扣在parafilm 膜上室温暗处孵育10min。 5.在parafilm 膜上加PBS缓冲液，待盖玻片被冲起后，再轻轻揭下盖玻片,用PBS缓冲液轻轻漂洗2次。 6.利用荧光显微镜观察细胞核、线粒体。
实验步骤 利用荧光显微镜观察细胞核、线粒体 将肿瘤细胞和正常组织细胞培养到小盖玻片上, 至细胞进入对数生长期 配制Ho.33342和罗丹明123 工作液: Ho.33342 (10μg/mL), 罗丹明123(10μg/mL)（溶于PBS缓冲液，pH7.4） 将盖玻片上的细胞用PBS缓冲液轻轻漂洗2次，分别滴加Ho.33342和罗丹明123工作液各10L，室温暗处孵育10min 用 PBS缓冲液轻轻漂洗2次，放在载玻片上制成的小室上 利用荧光显微镜观察细胞核、线粒体
思 考 题 1. 荧光显微镜的工作原理，及使用时应注意的问题。 2. 细胞核的形态的变化与功能的关系