高级光学显微镜的 结构及其使用

实验目的 1. 了解高级光学显微镜的原理、结构和各部件性能。 2. 掌握低倍镜、高倍镜的正确使用方法，熟悉油镜 的使用方法。 2. 掌握低倍镜、高倍镜的正确使用方法，熟悉油镜 的使用方法。 3. 熟悉光镜下各种不同类型细胞的基本形态与结构

实验用品 Nikon显微镜，Olympus多功能显微镜，擦镜纸，香柏油，标本片

实验内容 一、显微镜的成像原理 二、显微镜的基本结构 三、显微镜的主要性能参数 四、显微镜的使用方法

一、显微镜的成像原理 显微镜是根据透镜成像的原理，对微小物体进行放大的，当被检物体AB放在物镜前方的1-2倍焦距之间，光线通过物镜在镜筒中形成一个倒立的放大的实像A1B1，这个实像恰好位于目镜的焦平面之内，通过目镜后形成一个放大的倒立的虚像A2B2。通过调教装置使A2B2落在人眼睛的明视距离（250mm）处，使眼睛所看到的物体最清晰，即倒立虚像A2B2是在人眼球晶状体的两倍焦距之外，通过眼球后，在视网膜形成一个正立实像A3B3。

图1 光学显微镜的放大原理和光路图

二、显微镜的基本结构 光学显微镜由三部分组成：机械部分、照明部分和光学部分。 机械部分包括：镜筒、物镜转换器、镜臂镜座、 载物台、调焦螺旋。 机械部分包括：镜筒、物镜转换器、镜臂镜座、 载物台、调焦螺旋。 照明部分包括显微镜的光源。 光学部分包括物镜、目镜、聚光器和光阑。

图2 Olympus显微镜的结构图

（一）显微镜的照明部分 1.照明光源 光源可以是自然光源，也可以是电光源。利用自然光源，只需要反光镜即可。电光源常见的多为溴钨灯，体积较小，钨丝似点状，灯壳为石英玻璃。电压为12V，色光为连续光谱，色温一般在3200-3400K之间。装卸灯泡时，不能直接用手触摸灯壳，以免污染。

2.科勒照明 柯勒照明法是目前用于显微镜观察和显微摄影中最为理想的照明方法。 柯勒照明的基本原理是：光源的灯丝经光源聚光器及可变视场光圈后，第一次落在聚光器孔径光阑的平面处（灯丝像），而后，聚光器又将光源的灯丝像传入物镜，在物镜的后焦面平面处形成第二次灯丝像，因此，在被检物体的平面处没有灯丝像的形成，故在视野内看不到灯丝像。

图3 光学显微镜的照明方法 a 临界照明法 b 柯勒照明

该照明法的主要优点表现在：第一是照明均匀，因为在标本平面上成像的是视场光阑而不是灯丝；第二是通过调节视场光阑的大小和位置可以控制标本平面上照明区的大小和位置，当只需要观察标本的一部分时，通过缩小视场光阑，就可以减少照明区域，使标本的其他部分不受热。

（二）显微镜的光学部分 1. 物镜 根据前透镜与被检标本盖片之间的介质情况，可将其分为： （1）干燥系(dry system)物镜 以空气（ή=1）为介质 （2）水浸系(water immersion)物镜 以水（ή=1.333）为介质 W （3）油浸系(oil immersion)物镜 以油为介质 oil，oel，imm等标志

根据放大倍率的高低，可将其分为： （1）极低倍物镜 0.7×，0.5× （2）低倍物镜 1×～6×，NA在0.04～0.15之间 （3）中倍物镜 6×～25×，NA在0.15～0.40之间 （4）高倍物镜 25×～63×，NA在0.35～0.95之间 （5）油浸物镜 90×～100×，NA在1.25～1.4之间

根据物镜像差校正的程度，又可以分为： （1）消色差物镜(achromatic) 能校正红蓝二光的位置色差和黄绿光的球差，Ach。 （2）复消色差物镜(apochromatic objective) 能校正红绿蓝三色光的位置色差，同时能较好地校正红蓝二光的球差，Apo。 （3）半消色差物镜(semi apochromatic objective)，又叫萤石物镜(fluorite objective) 介于上面二者之间，FL。 （4）平场物镜(plan objective) 用来校正像场弯曲，可以和上边三种物镜配合形成PL， PL·FL，PL·APO

物镜外壳上的标志 （1）物镜的种类 APO(复消色差物镜)，FL(萤石物镜或半复消色差物镜)，PL(平场物镜)，PL·FL(平场萤石物镜)和PL·APO(平场复消色差物镜)。 （2）放大倍数 用数字表示，如4、10、20、40和100等。 （3）数值孔径 物镜的数值孔径，通常简写为N.A.,常和放大倍数写在一起,如10/0.25 ,40/0.65等。 （4）标准机械筒长(160mm) （5）需用盖片情况 常与机械筒长写在一起，如：160/0.17, 160/0, 160/-等 （6）物镜与被检样品间的介质情况 (Oil Hi W Glyz)

2. 目镜 目镜的作用是把物镜放大的实象（中间象）再放大一级，并把物象映入观察者的眼中，实质上目镜就是一个放大镜。已知显微镜的分辨率能力是由物镜的数值孔径所决定的，而目镜只是起放大作用。因此，对于物镜不能分辨出的结构，目镜放的再大，也仍然不能分辨出。 目镜可分下列几种: 1.惠更斯目镜 2.兰姆斯登目镜 3.补偿目镜(C or K)，与复消色差物镜配合使用，能将物镜残留的色差予以补偿。 4.平场目镜(Plan or P)，与平场物镜配合使用，能校正像场弯曲。 5.广视场目镜(W or WF)，可以使观察到的视野面积扩大。 6.高眼点目镜(H)，目镜的出射点与眼透镜的距离大，镜检者可带上眼镜进行镜检。 7.摄影目镜，专供显微摄影和投影用。

3. 聚光器 作用: 使来自光源的光线放大，并聚成光束，透过载片照明样品，射入物镜。 组成: 聚光镜和孔径光阑。 调节：光阑调节要适度，开度过小使聚光器和物镜的数值孔径下降，影响影像的分辨力，且降低成像质量；开度过大，引起产生眩光，降低影像的清晰度和反差；当开度与与物镜的数值孔径一致时分辨力最佳；一般调节至所用物镜数值孔径的70~ 80% 为宜。

三、显微镜的主要性能参数 显微镜的能力是质量和性能的标志。能力包括分辨率、放大率、焦点深度和视场宽度等。其中最重要的是分辨率，各种能力都有一定的界限，既互相作用、又互相制约。

1. 数值孔径（Numerical Aperture，NA） 也叫“镜口率”，简称NA值或A值。表示接物镜与被检样品之间介质的折射率（n）和孔径角半数的正弦乘积。 NA= n·sinα 图4 孔径角

2. 分辨率（Resolving power） 显微镜的分辨率是指能被显微镜清晰区分的两个物点的最小间距，又称“解像力”。其计算公式为 σ=λ/NA σ为最小分辨距离；λ为光线的波长；NA为物镜的数值孔径。可见物镜的分辨率是由物镜的NA值与照明光源的波长两个因素决定。NA值越大，照明光线波长越短，则σ值越小，分辨率就越高。 要提高分辨率，即减小σ值，可采取以下措施 （1） 降低波长λ值，使用短波长光源。 （2） 增大介质n值以提高NA值（NA=nsinu/2）。 （3） 增大孔径角u值以提高NA值。 （4） 增加明暗反差，也是提高清晰度的一项有利措施。。

3. 放大率（Magnification） 放大率也叫放大倍数，是指被检物体经物镜和目镜放大后，人眼所看到的最终图像的大小和原物体大小的比值，它是物镜和目镜放大倍数的乘积。 通常，显微镜的放大倍数是指对物体长度的放大。 （M）=Mob×Moc=△/F1 × 250/F2 M：总放大率，Mob：物镜放大率， Moc：目镜放大率 △：标准镜筒长160mm，F1，物镜焦距（单位mm）， F2，目镜焦距（单位mm），250：明视距离（单位mm） 一般认为，显微镜的最佳总放大率是在标准镜筒长度下，所使用物镜NA值的500～1000倍，在这一范围内的称为“有效放大率”，超出这一范围称为“无效放大”或“空放大”。

4. 焦点深度（Depth of focus） 焦深为焦点深度的简称，即在使用显微镜时，当焦点对准某一物体时，不仅位于该点平面上的各点都可以看清楚，而且在此平面的上下一定厚度内，也能看得清楚，这个清楚部分的厚度就是焦深。焦深大, 可以看到被检物体的全层，而焦深小，则只能看到被检物体的一薄层，焦深与其他技术参数有以下关系： （1） 焦深与总放大倍数及物镜的数值孔径成反比。 （2） 焦深大，分辨率降低。 　　由于低倍物镜的景深较大，所以在低倍物镜照相时造成困难。

5.视场直径（Field of view） 视场直径也称视场宽度，是指在显微镜下看到的圆形视场内所能容纳被检物体的实际范围。视场直径愈大，愈便于观察。 F=FN/Mob 式中F：视场直径，FN：视场数（Field Number, 简写为FN，标刻在目镜的镜筒外侧），Mob：物镜放大率。 由公式可看出： （1） 视场直径与视场数成正比。视场数为制造商给出的参数，通常标刻在目镜镜筒外表面。 （2） 增大物镜的倍数，则视场直径减小。因此，若在低倍镜下可以看到被检物体的全貌，而换成高倍物镜，就只能看到被检物体的很小一部份。

6.工作距离（Working distance） 　　工作距离也叫物距，即指物镜前透镜的表面到被检物体之间的距离。镜检时，被检物体应处在物镜的一倍至二倍焦距之间。因此，它与焦距是两个概念，平时习惯所说的调焦，实际上是调节工作距离。 　　在物镜数值孔径一定的情况下，工作距离短孔径角则大。 　　数值孔径大的高倍物镜，其工作距离小。

四、显微镜的使用方法 （一）光路合轴调整 （二）物镜和目镜的选用和组合 （三）光阑及其使用 （四）光学显微镜的维护

（一）光路合轴调整 1.聚光器的调中 (1)转动聚光器升降旋钮，把聚光器升至最高位置。 (2)接通光源灯的电源开关。 (3)将制片标本放在载物台上，用10倍或低倍物镜对样品聚焦。 (4)缩小视场光阑，在视场中可见边缘模糊的视场光阑图像。 (5)微降聚光器，至视场光阑的图像清晰聚焦为止。 (6)用聚光器两个调中螺丝推动聚光器，使缩小的视场光阑的 图像调至视场中心。 (7)开放视场光阑，使正多角形的周边与视场边缘相接，内接和外切均可。 (8)反复缩放视场光阑，确认光阑边缘与视场完全重合。 (9)使聚光器回复顶点位置。

图5 聚光器的调中

2.光源灯的调中 图6 光源灯的调中 左：调中前 右：调中后

（二）光阑及其使用 视场光阑控制照明光束，限定视场大小。孔径光阑通过光阑的放缩，限定聚光镜的孔径大小 图7 视场光阑 图8 孔径光阑

（三）光学显微镜的维护 1. 必须熟练掌握并严格执行使用规程。 2. 取送显微镜时一定要一手握住弯臂，另一手托住底座。显微镜不能倾斜，以免目镜从镜筒上端滑出。取送显微镜时要轻拿轻放。 3. 观察时，不能随便移动显微镜的位置。 4. 凡是显微镜的光学部分，只能用特殊的擦镜头纸擦拭，不能乱用他物擦拭，更不能用手指触摸透镜，以免汗液玷污透镜。 5. 保持显微镜的干燥、清洁，避免灰尘、水及化学试剂的玷污。 6. 转换物镜镜头时，不要搬动物镜镜头，只能转动转换器。 7. 切勿随意转动调焦手轮。使用微动调焦旋钮时，用力要轻，转动要慢，转不动时不要硬转。 8. 不得任意拆卸显微镜上的零件，严禁随意拆卸物镜镜头，以免损伤转换器螺口，或螺口松动后使低高倍物镜转换时不齐焦。 9. 使用高倍物镜时，勿用粗动调焦手轮调节焦距，以免移动距离过大，损伤物镜和玻片。 10. 用完后，必须检查物镜镜头上是否沾有水或试剂，如有则要擦拭干净，并且要把载物台擦拭干净。 11. 如实填写显微镜使用记录。

思考题 1. 熟练掌握高级光学显微镜的使用方法。 2. 试分析影响显微镜成像优劣的主要因素。