实 验 项目 流感病毒的分离与鉴定 医学检验实验教学中心
实验目的 1.掌握流感病毒的分离方法和鉴定方法 2.通过临床病例诊断，引导学生实验技术，总结归纳做病原学诊断 采集哪些标本的方法以及进行病原学检测的方法，做出临床诊断。
病毒感染的检查方法 电镜技术 血清学试验 分子生物学技术 病毒的分离鉴定 标本采集与送检
一、标本采集与送检 （一）供分离病毒、检出核酸及抗原的标本 （二）检测特异性抗体 的标本 采集双份血清，4-20℃保存 原则： 1.尽早采取：发病初期 2.部位适宜：由感染部位采取 3.冷藏速送：装有冰块或干冰的容器内 （二）检测特异性抗体 的标本 采集双份血清，4-20℃保存
病毒材料采集与检验结果的关系 采取标本的时期 检查病毒及其成分 测定抗体 潜伏期及前驱期 刚发病或急性期 恢复期及康复期 较难查见 最多查见 很难查见 未增多 未增多或增多不明显 明显增多 （常超过4倍）
二、常规分离与鉴定 病毒分离是诊断病毒感染的金标准，一旦阳性，即可确诊。 不适用于快速诊断，操作复杂，实验成本高，阳性检出率低等 有时不得不分离病毒，例如发现了一种新的病毒病，必须分离病毒进行研究，或者分离株的鉴定对流行病学有很大作用（如流感病毒），或者需要培育疫苗，或者希望获得天然弱毒株等。
（一）病毒分离 标本采集 杀灭杂菌 （青链霉素） 接种 鉴定病毒种型 易感动物 出现病状 鸡胚 病变或死亡 细胞培养 细胞病变 三大方法
流感病毒的分离与鉴定 标本采集 早期 鼻咽拭子 病人血清
鸡胚的结构与生理 鸡胚是由三个胚层发育起来的，即外胚层，中胚层和内胚层，它们构成胚胎的组织与器官。 （约10日龄鸡胚的结构见图）
鸡胚接种 （一）9~11日龄鸡胚 （二）孵卵箱 （三）检卵灯、开卵钻和卵盘 （四）其它
（一）活胚检查 1.血管：活胚可见清晰的血管，有时可见血管搏动，死胚血管模糊成淤血带或淤血块。 2.胎动：活胚可见明显的自然运动，尤其在转动胚胎时，死胚见不到任何胎动，胚胎发红像出血样，有的呈现黑块。 3.血管网是否丰满：发育好的鸡胚可见密布丰满的血管网，也就是绒毛尿囊膜，死胚则见不到这一现象。
（二）接种途径 1.尿囊腔接种：该途径一般用于流感、新城鸡瘟病毒和腮腺炎的适应和传代。 2.羊膜腔接种：这途径主要用于临床材料（如患者的鼻洗液及咽漱液）分离病毒。 3.卵黄囊接种：该接种途径主要用于抗流感病毒药物实验。 4.绒毛尿囊膜—壳块培养法：该法可用于流感病毒滴定、中和试验和药物实验。
注意事项 鸡胚为一活的有机体，因此要严格无菌操作，同时动作要仔细，以免造成物理死亡。接种后24小时内死亡应不计结果。 接种时应注意的问题？
收获鸡胚尿囊液 （见讲义） 血球凝凝试验 血球凝集抑制试验
细胞培养方法分离流感病毒鉴定 利用狗肾细胞培养观察CPE。常见的细胞形态学变化为细胞变圆、坏死、溶解、脱落或形成合胞体。有些病毒能形成包涵体。 病变细胞 正常细胞
免疫荧光技术检测 照片有本实验室提供
RT-PCR 检测流感病毒 RT-PCR 对流感病毒H3N2-IFV HA基因的检测
电子显微镜检查流感病毒 病毒的很多特征如大小、形态、结构等必须借助电子显微镜进行检查。对于目前尚难培养而形态又非常典型的病毒，可直接从感染组织或分泌液，或者接种病料的鸡胚和细胞培养收获的材料作电子显微镜检查，直接观察病毒粒子。
透射电子显微镜
负染技术 滤纸 负染是指通过重金属盐在样品四周的堆积而加强样品外周的电子密度，使样品显示负的反差，衬托出样品的形态和大小。 样品 染液（常用磷钨酸） 滤纸 铜网 1-2分钟后电镜观察
流感病毒形态
优点：快速简易（10-20min）；分辨率高；图象清晰地病毒结构 负染法的优缺点： 优点：快速简易（10-20min）；分辨率高；图象清晰地病毒结构 缺点：敏感性低，要求病毒量在107以上；所有样品应处于悬浮状态
问题和讨论 某患者，突然发病，有畏寒、发热、头疼、肌痛、厌食、乏力、鼻塞、流涕、咽痛和咳嗽等症状。热度可高达39C,WBC增高不明显。 （1）请你做出临床诊断； （2） 做病原学诊断应采集哪些标本？如何进行病原学检测？