第十章 酶的作用机制和酶的调节

主要内容 酶的活性部位 影响酶催化效率的有关因素 酶催化反应机制的实例 酶活性的调节机制 同工酶

9.1、酶的活性部位 （一）基本概念：酶的活性中心是指结合底物和将底物转化为产物的区域，通常是一级结构相隔很远，而三维结构比较靠近的氨基酸残基形成的三维实体。酶的活性中心包括两个功能部位：结合部位和催化部位。 1．结合部位（ Binding site） 酶分子中与底物结合的部位或区域一般称为结合部位。此部位决定酶的专一性。 2．催化部位（ catalytic site ） 酶分子中促使底物发生化学变化的部位称为催化部位。此部位决定酶所催化反应的性质。

（二）酶活性部位的特点 1.活性中心只占酶分子总体积的很小一部分，往往只占整个酶分子体积的1%-2%。 2.酶的活性部位是一个三维实体，具有三维空间结构。 3.酶的活性部位并不是和底物的形状正好互补的，而是在酶和底物的结合过程中，底物分子或酶分子、有时是两者的构象同时发生了一定的变化后才互补的，此时催化基团的位置正好处在所催化底物键的断裂和即将生成键的适当位置，这个动态辨认过程称为诱导契合（induced-fit）.

4.酶的活性部位位于酶分子表面的一个裂隙（crevice）内.裂隙内是一个相当疏水的环境，从而有利于同底物的结合。 5.底物靠次级键较弱的力与酶结合。 6.酶的活性部位具有柔性和可运动性

（三）研究酶活性部位的主要方法 酶分子侧链基团的化学修饰法 1. 非特异性共价修饰 2. 特异性共价修饰（DFP） 3. 亲和标记（底物类似物，具有活泼的化学基团） X- 射线晶体衍射法： 定点诱变法

DFP的作用 二异丙基氟磷酸

9.2、影响酶催化效率的有关因素 （一）底物和酶的邻近效应（approximation）与定向效应（orientation） 在酶促反应中，由于酶和底物分子之间的亲和性，底物分子有向酶的活性中心靠近的趋势，最终结合到酶的活性中心，使底物在酶活性中心的有效浓度大大增加的效应叫做邻近效应。 定向效应：当专一性底物向酶活性中心靠近时，会诱导酶分子构象发生改变，使酶活性中心的相关基团和底物的反应基团正确定向排列，同时使反应基团之间的分子轨道以正确方向严格定位，使酶促反应易于进行。以上两种效应使酶具有高效率和专一性特点。

咪唑催化对-硝基苯酚乙酸酯的水解反应

实验结果表明，分子内咪唑基参与的水解反应速度比相应的分子间反应速度大 24 倍。说明咪唑基与酯基的相对位置对水解反应速度具有很大的影响。

轨道定向(orbital-steering)假说示意图

Rate enhancement by entropy reduction Rate enhancement by entropy reduction. Shown here are reactions of an ester with a carboxylate group to form an anhydride. The R group is the same in each case.

（二）底物的形变（distortion） 酶-底物复合物形成时，酶分子构象发生变化，底物分子也常常受到酶的作用而发生变化，甚至使底物分子发生扭曲变形，从而使底物分子某些键的键能减弱，产生键扭曲，有助于过度态的中间产物形成,从而降低了反应的活化能。

诱导契合模型与底物的形变

（三）酸碱催化（acid-base catalysis） 酸-碱催化可分为狭义的酸-碱催化和广义的酸-碱催化。酶参与的酸-碱催化反应一般都是广义的酸－碱催化方式。 广义酸－碱催化是指通过质子酸提供部分质子,或是通过质子碱接受部分质子的作用，达到降低反应活化能的过程。 酸-碱催化是催化有机反应的最普遍有效的催化剂

酶分子中可作为酸碱催化的功能基团

影响酸碱催化反应的因素包括酸碱强度及质子传递的速率。 His咪唑基的解离常数约6.0，咪唑基解离下来的质子浓度与水中的[H+]相近，在中性条件下，一半以酸形式存在，一半以碱形式存在;同时，咪唑基接受质子和供出质子的速率十分迅速，半衰期小于10-10秒。 所以，His是酶中最有效最活泼的一个催化功能基团。

（四）共价催化 （covalent catalysis） 催化剂通过与底物形成反应活性很高的共价过渡产物，使反应活化能降低，从而提高反应速度的过程，称为共价催化。 酶中参与共价催化的基团主要包括以下亲核基团： His 的咪唑基，Cys 的硫基，Asp 的羧基，Ser 的羟基等；亲电子基团：H+ 、Mg2+、 Mn2+ 、Fe3+ 某些辅酶，如焦磷酸硫胺素和磷酸吡哆醛等也可以参与共价催化作用。

(五) 金属离子的催化作用 １.需要金属的酶分类： 　（1）金属酶－metalloenzyme:含紧密结合的金属离子。如Fe2+、Fe3+、Cu2+、Zn2+、Mn2+ 　　（2）金属-激活酶（metal-activated enzyme）:含松散结合的金属离子，如Na+ K+ Mg2+ Ca2+ 2.金属离子的催化作用： 通过结合底物为反应定向。 通过可逆的改变金属离子的氧化态调节氧化还原反应。 通过静电稳定或屏蔽静电荷。

（六）多元催化和协同效应 酶催化反应时常常是几个功能团适当排列共同作用。如胰凝乳蛋白酶活性中心处三个氨基酸残基组成“电荷中继网”，催化肽键水解；核糖核酸酶催化水解时，His12起广义碱催化作用，接受一个质子，而His119起广义酸作用，和磷酸的氧原子形成氢键。

（七）微环境影响 酶促反应在酶表面的疏水裂缝（活性中心）中进行，如同反应在有机溶剂中进行，反应基团不为溶剂化，亲核亲电反应均可加速。如溶菌酶Glu35的羧基在非极性区，催化功能增速3×106倍。

9.3、酶催化反应机制的实例 Next （一）溶菌酶 溶菌酶的生物学功能是催化某些细胞壁多糖的水解。 键张力导致与酶结合的底物特定位置的糖苷键稳定性降低。 溶菌酶催化机制是一个广义的酸碱催化，Glu35和Asp52在催化过程中起了重要作用。 Next

溶菌酶是一种葡糖苷酶，能催化水解NAM的C1和NAG的C4之间的糖苷键，但不能水解NAG C1和NAM C4之间的β（1-4）糖苷键。 Back

X射线晶体分析法揭示了溶菌酶的三维结构 活性部位？

(NAG)3是研究溶菌酶活性部位的良好竞争性抑制剂 60000 (NAG-NAM)3 30000 (NAG)6 4000 (NAG)5 8 (NAG)4 1 (NAG)3 (NAG)2 相对水解速率 底物 图像分析表明，(NAG)3仅仅占据了半个狭缝，酶的最小底物应该是(NAG)6

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第4个糖残基D环因空间原因必须由正常的椅式变形为能量较高的半椅式构象。因此糖苷键的稳定性降低，键容易从此断裂。

H218O溶液中酶促水解底物(NAG)6的实验证明酶切位点在D糖基的C1和E残基的糖苷键的O之间。 Back

Glu35的-COOH提供一个H+到D与E之间的糖苷键O原子上。糖苷键断开，形成正碳离子过渡态中间产物。Asp52对中间产物有稳定作用。EF离开酶分子。 正碳离子中间体与溶剂中的OH-反应， ABCD离开。同时Glu35质子化。 Back

（二）丝氨酸蛋白酶 丝氨酸蛋白酶家族的所有成员在其活性部位都含有Ser残基，并且催化机制也相似。 具有消化作用的丝氨酸蛋白酶是胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和弹性蛋白酶。 丝氨酸蛋白酶的催化机制提供了一种典型的酸碱催化和共价催化的例子。

丝氨酸蛋白酶 胰蛋白酶 胰凝乳蛋白酶 枯草杆菌蛋白酶 凝血酶 弹性蛋白酶 纤溶酶 组织纤溶酶原激活剂 Back

三种消化酶在胰腺中合成，以非活性的酶原形式分泌到消化道中，在消化道中通过蛋白酶水解除去部分肽链，转变成活性酶形式。

胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和弹性蛋白酶的底物结合口袋决定了各自的专一性。 Back

生理pH下，没有催化剂时，多肽极难水解。

不可逆抑制剂揭示了胰凝乳蛋白酶催化作用的关键氨基酸残基。 胰凝乳蛋白酶的Ser 195残基被DIPF修饰后，活性完全丧失。

胰凝乳蛋白酶机制可以通过人工合成底物——简单的有机酯进行研究。

胰凝乳蛋白酶同乙酸－p－硝基苯酯反应的动力学曲线

第二步是乙酰复合体通过水解再生为游离的酶，称为脱酰作用。 胰凝乳蛋白酶的机制分两个阶段： 第一步是乙酰复合体的形成，称为酰化作用。 第二步是乙酰复合体通过水解再生为游离的酶，称为脱酰作用。

胰凝乳蛋白酶的晶体结构显示，Ser195的异常反应性与催化三联体有关。 3个极性残基：His57、Asp102和Ser195在活性部位形成催化三联体。

胰凝乳蛋白酶中的催化三联体。

胰蛋白酶的催化机制

丝氨酸蛋白酶的催化机制

The Oxyanion Hole. The structure stabilizes the tetrahedral intermediate of the chymotrypsin reaction.

9.4、酶活性的调控机制 酶活性的调节可以通过改变其结构而使其催化活性发生改变，也可以通过改变其含量来改变其催化活性，还可以通过以不同形式的酶在不同组织中的分布差异来调节代谢活动。

（一）酶结构的调节 通过对现有酶分子结构的影响来改变酶的催化活性。这是一种快速调节方式。 别构调控 酶原激活 共价调控 Next

别构调控 酶分子的非催化部位与某些化合物非共价结合后发生构象的改变，进而改变酶活性状态，称为酶的别构调节（allosteric regulation）。 具有这种调节作用的酶称为别构酶（alloseric enzyme）。 凡能使酶分子发生别构作用的物质称为效应物（effector）或别构剂。 因别构导致酶活性增加的物质称为正效应物（positive effector）或别构激活剂，反之称为负效应物（negative effector）或别构抑制剂。

当别构酶的一个亚基与其配体（底物或别构剂）结合后，能够通过改变相邻亚基的构象而使其对配体的亲和力发生改变，这种效应就称为别构酶的协同效应。 别构剂一般以反馈方式对代谢途径的起始关键酶进行调节，常见的为负反馈调节。 A B C D P E1 E2 E3 En

典型的别构酶－天冬氨酸转氨甲酰酶（ ATCase ） 在E.coli中ATCase催化由氨甲酰磷酸和天冬氨酸生成氨甲酰天冬氨酸。 ATCase的一个最有效的抑制剂是代谢途径的终产物胞嘧啶三磷酸（CTP），而ATP是酶的激活剂。

N-氨基甲酰磷酸与天冬氨酸的结合是协同的，协同结合使底物浓度只在一个很窄的范围内开启N-氨甲酰天冬氨酸的合成。底物分子本身对别构酶的调节作用称为同促效应。 别构激活 别构抑制 V [S] 底物敏感区

CTP在不影响酶的Vmax的情况下，通过降低酶与底物的亲和性来抑制ATCase；ATP可增强酶与底物的亲和性，也不影响Vmax。这种非底物分子的调节物对酶的调节作用，称为异促效应。 别构激活 别构抑制 V [S] 底物敏感区

Two views of the regulatory enzyme aspartate transcarbamoylase. (Derived from PDB ID 2AT2.) This allosteric regulatory enzyme has two stacked catalytic clusters, each with three catalytic polypeptide chains (in shades of blue and purple), and three regulatory clusters, each with two regulatory polypeptide chains (in red and yellow). The regulatory clusters form the points of a triangle surrounding the catalytic subunits. Binding sites for allosteric modulators are on the regulatory subunits. Modulator binding produces large changes in enzyme conformation and activity.

别构酶的基本性质 别构酶一般是寡聚酶，通过次级键由多亚基构成。 因别构酶有协同效应，故其[S]对v的动力学曲线不符合米氏方程。 效应物可分为K型和V型两种类型。 别构酶经加热或化学试剂处理，可引起别构酶解离，失去调节活性，称为脱敏作用。

催化亚基 正协同 多亚基 协同效应 负协同 调节亚基 别构激活剂 别构抑制剂 Back

别构酶的动力学 [S]对v的动力学曲线不是双曲线，而是S形曲线（正协同）或表观双曲线（负协同），两者均不符合米氏方程。 1负协同 2米氏曲线 3正协同 3 2 1 V 0 [S]

正协同效应：底物或调节物的结合大大增加了酶对后续底物分子的亲和性。（S型曲线） 负协同效应：底物浓度较小的范围内，酶活力上升很快，随后底物浓度虽有较大提高，但反应速率升高很小，表现为负协同。（表观双曲线）

饱和比值（Rs）可用来鉴别不同的协同作用以及协同的程度。 具有正协同效应的别构酶Rs<81， Rs 正协同效应 具有负协同效应的别构酶Rs>81， Rs 负协同效应

意义： Back 在很小的浓度（底物、调节物）范围内严格控制酶活力，因此是生物代谢中许多代谢途径的关键酶。 V 1负协同 2米氏曲线 V 别构激活 别构抑制 V [S] 底物敏感区 2米氏曲线 1负协同 3正协同 3 2 1 V 0 [S] Back

K型效应物和V型效应物 K型 V型 Back

别构模型 齐变模型（WMC） 别构酶的所有亚基，或全部呈坚固紧密的，不利于结合底物的“T”状态，或者全部是松散的，有利于结合底物的"R"状态，这两种状态间的转变对于每个亚基都是同时的，齐步发生的。"T"状态中亚基的排列是对称的，变成"R"状态后亚基的排列仍然是对称的。

序变模型（KNF） 酶分子中的亚基结合小分子物质（底物或调节物）后，亚基构象逐个地依次变化，因此亚基有各种可能的构象状态。 Back

酶原的激活 处于无活性状态的酶的前体物质就称为酶原。 酶原在一定条件下转化为有活性的酶的过程称为酶原的激活。 酶原的激活过程通常伴有酶蛋白一级结构的改变。酶原分子一级结构的改变导致了酶原分子空间结构的改变，使催化活性中心得以形成，故使其从无活性的酶原形式转变为有活性的酶。 举例：消化系统蛋白酶原的激活，凝血机制。

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共价调控 酶蛋白分子中的某些基团可以在其他酶的催化下发生共价修饰，从而导致酶活性的改变，称为共价修饰调节。 共价调节酶的两个主要特点： 1、通过可逆的共价修饰调节酶活性； 2、导致级联式放大反应。

共价修饰的主要方式是磷酸化和脱磷酸化。 蛋白质 蛋白质－npi 蛋白激酶 蛋白磷酸酶

蛋白激酶A是cAMP依赖性蛋白激酶。

磷酸化酶激酶通过磷酸化作用使无活性的磷酸化酶b转化为有活性的磷酸化酶a。

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（二）酶含量的调节 酶含量的调节是指通过改变细胞中酶蛋白合成或降解的速度来调节酶分子的绝对含量，影响其催化活性，从而调节代谢反应的速度。这是机体内迟缓调节的重要方式。 酶蛋白合成的调节 酶蛋白降解的调节

酶蛋白合成的调节：酶蛋白的合成速度通常通过一些诱导剂或阻遏剂来进行调节。凡能促使基因转录增强，从而使酶蛋白合成增加的物质就称为诱导剂；反之，则称为阻遏剂。 常见的诱导剂或阻遏剂包括代谢物、药物和激素等。

9.5、同工酶 在同一种属中，催化相同的化学反应，而酶蛋白的分子结构，理化性质及免疫学性质不同的一组酶称为同工酶。 同工酶在体内的生理意义主要在于适应不同组织或不同细胞器在代谢上的不同需要。因此，同工酶在体内的生理功能是不同的。

乳酸脱氢酶同工酶（LDHs）为四聚体，在体内共有五种分子形式，即LDH1（H4），LDH2（H3M1），LDH3（H2M2），LDH4（H1M3）和LDH5（M4）。 心肌中以LDH1含量最多，LDH1对乳酸的亲和力较高，因此它的主要作用是催化乳酸转变为丙酮酸再进一步氧化分解，以供应心肌的能量。在骨骼肌中含量最多的是LDH5，LDH5对丙酮酸的亲和力较高，因此它的主要作用是催化丙酮酸转变为乳酸，以促进糖酵解的进行。