实验九 葡萄糖氧化酶法 测定血清葡萄糖

一、实验目的 (1)了解血糖的概念。 (2) 掌握血糖的测定方法——葡萄糖氧化酶法。

What？ 血糖及正常血糖水平: 血糖：指血液中的葡萄糖. 正常血糖浓度： 空腹波动在3.89～6.7mmol/L（70～110mg/dl） 餐后2h内应≤7.8mmol/L（≤140mg/dl）。

血糖的来源、去路

血糖水平恒定的生理意义 保证重要组织器官的能量供应，特别是某些以葡萄糖供能的组织器官。 脑组织不能利用脂酸，正常情况下主要以来葡萄糖供能； 红细胞没有线粒体，完全通过糖酵解获能； 骨髓及神经组织代谢活跃，经常利用葡萄糖供能。

血糖测定的常用方法 HOW？ 无机化学法： Folin-Wu法 测定方法 有机化学法：邻甲苯胺法 酶法：葡萄糖氧化酶法

（一）化学法 方法 类型 原 理 用途及备注 磷钼酸法 定量 G+Cu2+→Cu2O↓ 稳定、准确、但对 方法 类型 原 理 用途及备注 磷钼酸法 定量 G+Cu2+→Cu2O↓ 稳定、准确、但对 （Folin-Wu） 分光 Cu2O +磷钼酸试剂 →蓝色钼化合物 葡萄糖无特异性， 　　　　　　　　　　　　（430nm）　　　　　　　 受血中非糖还 原物 质的影响。 邻甲苯胺法 定量 G+邻甲苯胺→蓝绿色的席弗(Schiff)碱 较Folin-Wu法特异 　　　　　　　　　　　（630nm）　　　　　 但不及酶法。 　　　　　　　　　　　　　　　　　　 D-甘露糖能与邻甲 　　　　　　 　苯胺反应，生成类 　　　　　　　　　 　　　　　　　　　　　 似吸收光谱，造成 　　　　　 正误差。

（二）酶 法 酶法分析是指用酶作为工具定量测定某种物质含量的分析方法。定量分析的目标可以是酶的底物，辅酶，也可以是酶的激活剂或抑制剂。

酶法分析的主要方法： 单酶反应定量法和偶联酶反应定量法 酶法分析的主要方法： 单酶反应定量法和偶联酶反应定量法 单酶反应定量法：指用一种酶为工具酶定量测定某种物质的方法。 偶联酶反应定量法：当单酶反应底物或产物反应底物或产物的物理化学手段无法区分时，还可以借助另一种酶作为指示酶，通过偶联反应进行定量分析。

方法 类型 原 理 用途及备注 己糖激酶 定量 G+ATP→G-6-P+ADP 血清尿液脑脊液、 方法 类型 原 理 用途及备注 己糖激酶 定量 G+ATP→G-6-P+ADP 血清尿液脑脊液、 （HK）法 分光 G-6-P + NADP+ 公认参考方法 　　　　 　动态 →GA-6-P + NADPH 操作简便，特异 　　　　 　终点 　（340nm） 性和灵敏性均高 　　　　　　　　　　　　　　　　　　 推荐常规方法 葡萄糖氧 同上 G+O2 → GA+H2O2 　化酶（POD） H2O2 + 染料→有色染料 　偶联法 （还原型） （氧化型） 可制试纸片定量 （Trinder） 　（4-氨基安替比林+酚 半定量筛选试验 　　　 →红色琨类化合物505nm）

葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法原理 葡萄糖酸＋H2O2 H2O ＋红色醌式物质 （1）葡萄糖＋O2＋H2O 葡萄糖氧化酶（GOD） 葡萄糖酸＋H2O2 （1）葡萄糖＋O2＋H2O （2）H2O2＋4-氨基安替吡啉＋苯酚 过氧化物酶 （POD） Trinder反应 方法评价： 此方法特异性高、准确、简便，还可用于自动分析仪 H2O ＋红色醌式物质 505nm 相对血糖浓度 光吸收法测定

试剂 标准管(ml) 测定管 (ml) 空白管(ml) – 0.03 3.00 实验步骤： （1）取3支试管，按下表加入试剂: 试剂 标准管(ml) 测定管 (ml) 空白管(ml) 血清样品 – 0.03 葡萄糖标准液 蒸馏水 酶酚混合试剂 3.00 充分混匀，37℃ 水浴中保温20min； 冷却至室温后，505nm处比色 比色方法：以空白管调零，读取标准管及测定管吸光度值。

（2）计算 依据朗伯-比尔定律： A=KLC 血清葡萄糖= （mmol/L） 参考值： 空腹血清葡萄糖浓度:3.89～6.11mmol／L 测定管吸光度 标准管吸光度 × 标准液浓度

注意事项： 本法用血量甚微，操作中应直接加标本至试剂中，再吸试剂反复冲洗试管。 此法可直接测定脑脊液葡萄糖的含量，但不能直接用于测定尿液葡萄糖含量。因为尿液中尿酸等干扰物质浓度过高，可感染过氧化物酶发硬，造成结果假性偏低。 严重黄疸、溶血及乳糜样血清应先制备无蛋白血滤液，然后再进行测定。

临床意义： 生理性高血糖：摄入高糖食物，情绪紧张 病理性高血糖： 生理性低血糖：见于饥饿和剧烈运动 ①糖尿病 ②内分泌腺功能障碍 ③颅内压增高 ④脱水引起高血糖 生理性低血糖：见于饥饿和剧烈运动 病理性低血糖：特发性功能性低血糖，依次是药源性，肝源性和胰岛素瘤等。 调节血糖水平的激素：胰岛素、胰高血糖素、糖皮质激素和肾上腺素。

思考题： 本实验原理为酶促化学反应，为何未加终止剂终止酶的反应？ 本实验涉及显色反应，该反应与血清碱性磷酸酶活力测定中的显色反应有何异同？ 为何不同检测方法所提供的空腹正常血糖参考值存在差异？ 葡萄糖氧化酶法： 3.89~6.11mmol/L Folin-Wu法： 4.4~6.7mmol/L 邻-甲苯胺法： 3.89~6.11mmol/L