第一章 蛋白质的分离与纯化

SDS-PAGE技术（主要掌握）、IEF（一般了解） 蛋白质的浓缩（了解） 蛋白质分离纯化的一般原则（掌握） 分配层析的基本理论（重点掌握） 蛋白质的层析分离技术 离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等 主要掌握操作要点及操作过程的注意事项 蛋白质的电泳分离技术 不连续系统原理（重点掌握） SDS-PAGE技术（主要掌握）、IEF（一般了解） 蛋白质的浓缩（了解）

第一节 蛋白质分离纯化的一般原则

蛋白质纯化的一般设计原则 1. 材料的选择与破碎 2. 建立蛋白质的活性测定方法 3. 分离纯化应遵循分级分离、先粗后细的原则 4. 分离纯化条件

材料的选择 根据实验目的选择合适的材料，应遵循： 材料来源方便、成本低、易操作 目的蛋白含量及生物活性尽可能高 可溶性及稳定性要尽可能好

注意：不同的生物体、不同生理状态、不同组织细胞的蛋白质含量和分布有很大差异 　　预处理：将不必要的结缔组织、脂肪组织等在尽可能接近生命状态下剔除，处理后应立即使用或在冷库中保存

细胞的破碎 先要将细胞和组织破碎，使蛋白质充分释放出来 机械法 匀浆：破碎机体软组织最常用方法之一 组织捣碎：注意维持低温环境 研磨：破碎单一细胞的有效方法，主要用于细菌、酵母等的破碎

物理法 超声法：输入高能超声波可以破碎细胞，破碎效率取决于声频、声能、处理时间、细胞浓度及细胞类型等 在处理少量样品时操作简便、效率高，液量损失少，适于实验室使用 注意: 超声波产生的化学自由基团能使敏感的活性物质变性失活，另外噪声也比较大

反复冻融法：由于在此过程中易使活性蛋白失活，故适用于提取非常稳定的蛋白质 冷热交替法：绝大多数细胞被破坏，一般适用于从细菌或病毒中提取蛋白质 低渗裂解：是指无胞壁细胞在低渗溶液中通过渗透张力作用裂解的方法，常用于红细胞的裂解

化学法 有机溶剂法：有些有机溶剂(如苯、甲苯等)可以改变细胞壁或膜的通透性，使内含物有选择性的渗透出来 表面活性剂(surfactant)：常用的有十二烷基磺酸钠、TritonX-100、去氧胆酸钠等 酶解法：必须根据细胞的结构和化学组成选择适当的酶

特异、快速、精确、可重复、经济 总蛋白含量 蛋白质比活性（specific activity） 得率

利用溶解度的差异分离 盐析法：最经典的方法，常用来进行粗分离 常用中性盐，主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠等，其中应用最广的是硫酸铵 影响盐析的因素很多，如pH、温度、蛋白质浓度等都会影响各种蛋白质的盐析点

盐析 疏水作用 (非极性残基不能与水形成氢键， 倾向于避开水)

硫酸铵沉淀

有机溶剂沉淀法：有机溶剂能降低溶液的介电常数，从而增加蛋白质分子之间不同电荷的引力，导致溶解度的降低；另外有机溶剂与水的作用，能破坏蛋白质的水化膜，使蛋白质在一定浓度的有机溶剂中沉淀析出

等电点法：当蛋白质处于等电点pH时，蛋白质的净电荷为零，由于相邻蛋白质分子之间没有静电斥力而趋于凝集 (aggregation)和沉淀 (precipitation)，它的溶解度达到最低 温度：在一定温度范围内(0～40℃之间)，大部分球状蛋白质的溶解度随温度升高而增加

等电点沉淀

根据分子量的不同分离 透析(dialysis)和超滤(ultrafiltration)：是利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质，使蛋白质和其它小分子物质如无机盐、单糖、水等分开 透析过程 平衡离心法：根据蛋白质分子大小、形状不同进行分离的技术 凝胶过滤 (gel filtration)：又称分子筛层析(molecular sieve chromatography)，这是根据分子大小分离蛋白质混合物的最有效方法之一

根据电荷的不同分离 电泳 离子交换层析 区带电泳：如醋酸纤维薄膜电泳，PAGE等 Agilent 3D CE 毛细管电泳系统 等电聚焦 (isoelectric focusing, IEF) ：具有更高分辨率的电泳技术 电泳 毛细管电泳(capillary electrophoresis, CE) ：在细孔管或毛细管中进行电泳分离。柱效高、分析时间短，所用样品量及试剂消耗少，操作模式多，可以进行在线检测和自动化 离子交换层析

亲和层析 亲和层析法可在温和条件下操作，纯化过程简单、快速、分辨率高，对分离含量少且性质不稳定的生物活性物质极为有效 注意：应该尽量减少纯化步骤，缩短操作时间

目的：避免目的蛋白的变性，保证其生物活性 缓冲液 (buffer) 盐、金属离子和螯合剂 还原剂 去垢剂 (detergent) 蛋白酶抑制剂 蛋白质的环境因素

第二节 分配层析的基本理论 Rate theory 1906年 M.Tswett Absorption Chromatography 第二节 分配层析的基本理论 1906年 M.Tswett Absorption Chromatography 1941年 Martin and Synge Partition Chromatography Plate theory Rate theory

一、分配定律 定量的S溶剂中，再加入一定量的M溶剂 相的A物质的分子数完全相等)时，其分配系数为常数 CAS = K CAM 分配定律表明： 一定的条件下，一定的物质其K值不变 条件改变其K值随之改变 K值大于1，物质在S相中的浓度大于其在M相中浓度

二、分配层析的机理 （1）层析柱可分成许多层，右面是流动相M，左面是固定相S，M和S是互不混溶 假设有两种物质，在一定的条件下，它们的分配系数K不同，则通过一根分配层析柱可以将它们分离。为了便于讨论，我们做如下几个假设： （1）层析柱可分成许多层，右面是流动相M，左面是固定相S，M和S是互不混溶 （2）分配层析柱中，每一层左右相通，层与层之间互不相通，也就是说在层析柱中只有横向扩散而无纵向扩散 分配层析柱理论塔板示意图

（3）在分配层析柱中，溶质在两相中达到分配平衡的速度很快，并且A物质的存在不影响B物质的分配性质，反之亦然 CAS CBS KB = KA = = 1/3 = 1 CBM CAM

如果在层析开始时，在第一层的S相中同时加入A和B两种物质，加入的量均为一。根据分配定律，A和B加入后，在两相中立刻进行分配，并且很快达到分配平衡。第一次分配前后A和B物质在S和M相中的量为：

A和B物质在层析柱中 1. 分配10次；2. 分配20次；3.分配30次

理论曲线和实际洗脱曲线是否相符？ 二者之间总是存在着一定的偏差，这是因为： 层析柱中总是或多或少地存在着纵向扩散 层析过程不可能在绝对分配平衡的情况下进行 因此，通常实际的洗脱曲线都比理论曲线低而宽

一根分配层析柱上到底能进行多少次分配？ 求得一个理论塔板的高度为0.002厘米 Verzele计算为0.02厘米 Martin和Synge计算了硅胶柱的理论塔板数， 求得一个理论塔板的高度为0.002厘米 Verzele计算为0.02厘米 1厘米的层析柱最少有50个理论塔板，那么， 在一根20厘米的层析柱上最少可以进行1000 次分配。

三、塔板理论 塔板理论的要点： 一理论塔板，其高度为理论塔板高度。在一定的 条件下，一根分配层析柱的理论塔板数是一定的 分配层析柱象分馏柱一样可以分成很多层，每层为 一理论塔板，其高度为理论塔板高度。在一定的 条件下，一根分配层析柱的理论塔板数是一定的 在分配层析柱中，物质只有横向扩散，没有纵向扩 散，而且在两相间达到分配平衡的速度很快 体系中其他物质的存在不影响待分离物质的分配。 待分离物质的存在也不影响其他物质的分配 在分配层析柱上，物质在各个理论塔板中的含量可 通过计算求得