Substrate binding site Lysozyme 活性區 N-acetylglucosamine (NAG) 兩個酸基在 pH 5 下有不同形式 O :O D E H-O O E E35 C O OH D52 O- First product E35 C O O-H O D OH D52 C O O- E35 C O O- D52 H-O-H : Non-polar environment sp2 Polar environment + N-acetylmuramic acid (NAM) D O O sp3 sp2 Electrostatic catalysis Chair → Half-chair NAG-NAM-NAG-NAM-NAG-NAM- Lysozyme 活性區形成一個狹長的凹陷谷，上面有幾個重要胺基酸 (左下圖)。 基質是細菌細胞壁上的多糖長鏈，活性區剛好容納六個糖類單位 (以氫鍵抓住多糖)，當基質就位後，D 單糖的六角形分子，就由 chair 扭曲成 half-chair 的構形，並由 Asp52 啟動催化反應 (如動畫)。 反應的中間過渡狀態 carbonium 是 sp2 形式，half-chair 有利於此過渡狀態的電子軌域。而此過渡狀態的正電荷，也會被 D52 的-COO- 所穩定。 活性催化都由酸性胺基酸擔任，然而兩個 -COOH 酸基的解離形式卻不一樣 (右上)。雖然都在 pH 5 下反應，然而活性區內的微環境卻造成 D52 解離，而 E35 卻帶有質子。 A B C D E F H-bonds Substrate binding site Stryer (2002) Biochemistry (5e) p.199, Fig 8-7 E5A-1

Catalytic toolkit for active sites 三連 Arg-Arg-Arg 正電集團 Asp-Asp 酸鹼配對 (Thr 定位) Asp-Arg 離子配對 (影響 pKa) Arg…Asp-COO- (親核攻擊) Arg, carboxlyate Asp-Lys-Thr triad (reactive -O-) Asp-Lys 配對 (調節 Tyr pKa) KEK (EK 控制 K112 pKa) 簡單的酸鹼對 (質子供需) Lysine Asp-His-Ser triad (reactive -O-) Asp-His 配對 (攻擊基質) His-His dyad (H83 攻擊磷酸) Combinations of different residues form ‘catalytic units’ that are found repeatedly in different unrelated enzymes Histidine 上排：以 Arg 及 –COO- 為催化基團。(a) Adenylate kinase 有三個 Arg 極化基質，上面的幾個 Asp 可稀釋 Arg 的正電。(b) Cardosin 中間的 Asp215 及 Asp32 形成酸鹼配對，而各自附近的 Thr218 及 Ser35 則可固定這兩個 Asp，但不會影響其 pKa。(c) Asp180 及 Arg179 連接成離子對，提高 Asp 的 pKa，以利催化反應之酸鹼要求。 (d) Asp192 必須保持親核攻擊能力，因此 Arg190 在附近協助維持其 –COO- 的形態。 中排：以 Lys 為催化主力。(a) Asparaginase triad 活性區中 Asp-Lys 配對，以接力奪走 Thr95 上的質子，成為 reactive Thr。 (b) 另一 Asp-Lys 配對，對 Tyr58 並非產生 –O-，而是調節 Tyr 的 pKa。(c) Lys-Glu-Lys triad 中的 Lys112 是作為酸鹼基，而 Glu51-Lys53 則控制 Lys112 的 pKa。(d) 簡單的 Glu-Lys 酸鹼對，都在提供或暫存質子。 下排：以 His 為關鍵。(a) 有名的 Ser-His-Asp triad 由 His-Asp 奪取 Ser 的質子。(b) 由 Asp 與 His 形成的酸鹼 dyad，直接對基質作用 (右上)。(c) Phosphotransferase 中罕見的 His-His dyad，His83 的 Ne 攻擊磷酸，必須由 His68 確保其正確 tautomer，並穩定過渡狀態；而 Thr86 又維持 His 68 正確 tautomer 形態。 Histidine Gutteridge A, Thornton JM (2005) Understanding nature’s catalytic toolkit. TIBS 30: 622 E5A-2

E5A-3 Amazing histidine WIKIPEDIA 被採用數目 被採用頻率 H57 S195 D102 Histidine 上 imidazole 環有兩個碳原子，其中一個帶有質子，另一個則無 (請不要忘掉這個氮上有 lone pair 電子)。雖然一般把較近 a 碳那個氮記為 N-H，但是因為共振的關係，其實那個質子可在兩個氮上轉移 (右上圖)。 非常令人驚訝地，統計活性區上面的重要胺基酸種類，發現 His 無論在絕對數目上，或者被利用的頻率上，都穩居第一名，比第二名的 Cys 高出一倍。Cys 在活性區的數目雖然不多，但是一旦 Cys 出現在活性區，就是很重要的催化點 (左圖)。 除了 His 及 Cys，極性胺基酸橫掃前十名，也是意料中的事。Ser protease 的 catalytic triad 就佔有第一 (His)、第三 (Asp)、第八名 (Ser)，並請注意三者的空間排列 (中央圖)。 Petsko GA, Ringe D (2004) Protein Structure and Function F4-35 WIKIPEDIA Gutteridge A, Thornton JM (2005) TIBS 30: 622 E5A-3

Histidine proton shuffle Ribonuclease O R3’ O PO2- R3’ R5’ Base H HN N+-H H119 HN N+-H H119 N+ NH H12 H PO2- :N+ NH H12 O R5’ Base Histidine proton shuffle HO R3’ First product 質子供應者 質子強奪者 :N+ NH H12 HN N+-H H119 HN N: H119 N+ NH H12 H H-O-H O PO2- OH R5’ Base PO2- O R5’ Base 兩個 His 的作用不同：一個是質子供應者 (H119)，另一是質子奪取者 (H12)。H12 奪取基質醇基上的氫，剩下的親核性氧原子攻擊磷酸中的 P，在另一個 His119 的協助下，造成磷酯鍵的斷裂。 再下來的水解部份 (下半)，剛好是前半的相反過程。Lys41 的正電，可以穩定中間過渡狀態上面，磷酸的高負電性。 H119 先借一個質子給基質，然後由水分子取回一個質子，好像 shuttle 一般。 E5A-4

Multifunctional enzymes (1) One active site, two reactions (2) Two active sites, two reactions (3) Trifunctional enzyme with tunnel Carbamoyl phosphate synthetase → 演化真是無限可能 Tryptophan synthase↓ AICAR transformylase - IMP cyclohydrolase (ATIC) Petsko GA, Ringe D (2004) Protein Structure and Function F2-44, 45 E5A-5

Enzymes also has non-catalytic functions Zheng, L et al (2003) S phase activation of the histone H2B promoter by OCA-S, a coactivator complex that contains GAPDH as a key component. Cell 114: 255~266 WIKIPEDIA Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase GAPDH has several functions: (0) Glycolysis enzyme (1) Transcription cofactor (2) Initiates apoptosis (3) ER to Golgi transportation Other examples: Phosphoglucose isomerase (Glycolysis & Cytokine) LON (Mitochondrial protease & Chaperone protein) 非常 令人意外，酵素經常還有催化以外的功能，這些功能不旦無關催化，也與該酵素原來的代謝途徑，幾乎完全沒有關係。 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) 是糖解作用中的關鍵酵素，廣泛存在於各種生物細胞中。在 2003 年首度被發現 GAPDH 可以進入細胞核中，形成轉錄複合體後調節某個基因的表現 (Histone H2B)。後來有越多報導，發現 GAPDH 與細胞程式凋亡、蛋白質運送，甚至入侵病毒的基因表現都有控制的角色。 除了 GAPDH 外，其他不少酵素也被發現有類似的多重角色。