NGS-STR分型 在个体识别和亲子鉴定中的应用初探 法庭科学新技术应用高峰论坛（2016年11月17日佛山） NGS-STR分型 在个体识别和亲子鉴定中的应用初探 孙宏钰 中山大学中山医学院法医学系 1

Part I 前 言

法医STR分型 基于CE平台的PCR-STR检测是现阶段法医DNA实验室的金标准 Forensic DNA Casework DNA Databases Mass Disasters Missing Persons Parentage and Kinship Testing Genetic Genealogy & Answering Historical Questions Authenticating Human Cell Lines Monitoring Transplants …… 更多Loci组合的有限性 长度多态性检测：未充分利用遗传标记信息  中国法庭DNA数据库已有3877.1（4400）万条数据 已认定比中391.9万次 现场生物物证入库比中率35.34% Set the stage – where is forensic DNA analysis currently? Now the real world Note: include pictures or graphical representation of current workflow here – show people in the lab – keep an emotional bond! This will help to frame our message around what our customers currently know and experience daily. Then we show them the future potential with the next slides – and that this future is already happening now! This slide serves 3 purposes its showing customers something they know and it also reassures them that they‘ve been doing a good job so far. And finally – it plays on our strengths So current situation (additional arguments listed here in order not to overload slides!) STR / CE is still gold standard Fast! If needed the police can get a result in a few hours – (no NGS method can do this currently!) Able to cope with high throughput via automation Widely accepted – helped to build DBs worldwide and still growing Most Labs have validated this workflow & are accreditated accepted in court

DNA序列分析技术—下一代测序（NGS）

DNA序列分析技术—下一代测序（NGS） 大规模平行测序 Massively parallel sequencing (MPS)

DNA序列分析技术—下一代测序（NGS）

基于NGS平台的法医STR分型 合适的时机从长度多态性关注到多态性来源最本质的序列多态性 长度多态性 序列多态性

Part II 材料和方法

实验材料 样本： 阳性对照： 42个广东汉族个体血痕样本（3.0mm血片） 包含14个父母子二代家系 已采用Goldeye 20A体系进行19个STR基因座荧光标记复合扩增和毛细管电泳检测，每个家系都包含1～2个STR突变位点 阳性对照： 007 (Thermo Fisher) 9947A (Promega)

实验方法 DNA提取： AutoMate ExpressTM自动化提取系统 PrepFiler® BTA Forensic DNA Extraction Kit Qubit®3.0定量 DNA浓度 标签序列 在建库的时候，对每一个样品接头上加上不同的标签序列，然后用于测序，在测序结果中，依据之前标签与样品的对应关系，就可以获得对应样品的数据，从而就有所谓的数据量为1G，2G。

实验方法 文库构建： 样本文库构建 Early Access STR Kit （24个STR基因座） 11个CODIS核心位点： CSF1PO, D3S1358, D5S818, D7S820, D8S1179, D13S317, D16S539, D21S11, TH01, TPOX, vWA 5个CODIS补充核心位点： D1S1656, D2S1338, D2S441, D10S1248, D19S433 8个非CODIS核心位点： D14S1434, D1S1677, D2S1776, D4S2408, D5S2500, D6S1043, D6S474, D9S2157 样本文库纯化 磁珠 Agencourt® AMPure® XP Reagent (Beckman Coulter) 标签序列 在建库的时候，对每一个样品接头上加上不同的标签序列，然后用于测序，在测序结果中，依据之前标签与样品的对应关系，就可以获得对应样品的数据，从而就有所谓的数据量为1G，2G。

实验方法 模板制备： 文库定量 qPCR定量到40-60pM 乳化PCR Ion PGM™ Hi‑Q™ Chef Kit（Thermo Fisher） 阳性珠子的富集 Ion Chef

实验方法 测序反应： Ion PGM 半导体测序 ION PGM™ Hi-Q™ Sequencing Kit（Thermo Fisher） Ion 318™ 芯片：1G Ion 316™ 芯片：100M Ion PGM 通过检测pH值变化来进行测序，直接将化学信号转换为电信号。

实验方法 数据分析： PGM测序数据分析 HID STR Genotyper Plugin v3.1 BAM 文件用IGV_2.3.72分析 FASTQ文件用STRait Razor v2.6分析 PGM分型数据和CE分型数据比较 PGM家系数据分析

Part III 实验结果和讨论

NGS-STR基因座分型 分型结果 所有样本的分型结果总览 等位基因及其Stutter峰图 等位基因的核心序列简式

NGS-STR基因座分型 分型结果输出格式

NGS-STR基因座分型 分型结果输出格式

PGM检测平台的STR基因座分型 阳性对照结果

NGS-STR检测的数据质量 测序覆盖深度（ depth of coverage, DoC）

PGM检测平台的数据质量 Stutter占主峰的峰面积比： Stutter出现比率：

PGM检测平台的数据质量 等位基因的杂合峰高比

NGS-STR与CE-STR的一致性研究 CE和NGS平台的STR分型一致性： 42个样本和2个阳性对照DNA样本（9947A，007），共1232个等位基因，分型一致率为98.13%。 不一致原因分析 等位基因丢失 D21S11基因座X.1、X.2、X.3结构 多一个重复单位

等位基因（Isoallele） 各个基因座的等位基因个数

等位基因（Isoallele）

亲子鉴定 Goldeneye 20A和Early Access STR Kit重叠基因座共14个： 14个三联体二代家系： CSF1PO, D2S1338, D3S1358, D5S818, D6S1043, D7S820, D8S1179, D13S317, D16S539, D19S433, D21S11, TH01, TPOX and vWA 14个三联体二代家系： 3个：母源突变（其中2个是多步突变） 3个：父源突变 3个：突变来源不明 3个：有突变，但未涵盖在重合的14个基因座中

Part IV 小 结

NGS-STR分型的优点 检测序列多态性——信息更充分利用，提高多态性； 可组合的STR基因座的个数不受荧光种类限制； 对等位基因亲本来源的识别能力； 对混合样本潜在的检测能力。

NGS-STR分型尚需解决的问题 可读序列的评价标准 等位基因的命名标准 与CE数据的可兼容性 群体数据 结果评判依据和标准 检测时间和成本