WESTERN BLOTTING 基本原理与方法

Western blotting与印迹法 印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。 1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNA－RNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。 对RNA的印迹分析称为Northern印迹法 单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法

Western blot 实验原理 Western blot是利用已知的特异性抗体与抗原（即组织细胞中的目的蛋白）能特异性结合的原理，通过化学反应使标记于结合后的特异性抗体上的显示剂（如酶、金属离子、同位素）显示一定的颜色或发光来对组织细胞内目的蛋白定性及半定量的研究。

Western Blot 优点 高分辨率的电泳技术 特异敏感的抗原-抗体反应 1-5ng中等大小的靶蛋白 Western Blot结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异敏感等多种优点，可检测到低至1～5ng（最低可到10－100pg）中等大小的靶蛋白。

Western Blot应用 目的蛋白的表达特性分析 目的蛋白与其它蛋白的互作 目的蛋白的组织定位 目的蛋白的表达量分析

WB实验流程

Western blot 检测蛋白表达实验流程 蛋白浓度测定 SDS-聚丙烯 酰胺凝胶电泳 提取总蛋白 一抗 封闭 转膜 洗涤 二抗 洗涤 分析 扫描 ECL检测

实验仪器

1、制胶

Western Blot 流程 蛋白样品的制备 SDS-PAGE 转膜 封闭 一抗杂交 二抗杂交 底物显色

不连续电泳： 作用 缓冲液PH 凝胶浓度 电泳缓冲液：pH8.3 Tris-甘氨酸系统。 浓缩胶 使蛋白样品浓缩 pH6.8Tris-Cl 低，2-5% 分离胶 使蛋白样品分离 pH8.8Tris-Cl 高，根据蛋白大小 PAGE分为连续系统和不连续系统两大类。连续系统电泳体系中缓冲液pH值与凝胶中的相同。带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。不连续系统中带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应、分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。 电泳缓冲液：pH8.3 Tris-甘氨酸系统。

Western Blot

图中绿色的是夹玻璃片的架子

玻璃板对齐后放入架中，把两侧的夹子卡紧。要使短玻璃靠外，长玻璃靠内。

然后垂直卡在架子上准备灌胶。操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。 图示两块玻璃板放在一个架子上。

配10％分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶时，可用10ml枪吸取5ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型。）

当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。再等3min使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。 按前面方法配4％的浓缩胶,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。

均匀插入梳子

梳子已经插好。插梳子时要使梳子保持水平。由于胶凝固时体积会收缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶。

浓缩胶干后，用手拿住梳子的两边均匀用力，拔起梳子

将玻璃板从夹子上取下，用水冲一下

将玻璃板放入电泳槽中。小玻璃板面向内，大玻璃板面向外

插入另一块玻璃板，也是小玻璃板面向内，大玻璃板面向外。若只跑一块胶，那槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向外

两块玻璃板都放好后夹紧（拇指按下夹子）

放入电泳槽中

向内槽中加电泳缓冲液，如果不漏，在向外槽中加，如果漏，就要重新把玻板查好，使内外不交通。 电泳液至少要漫过内侧的小玻璃板。

测完蛋白含量后，所有蛋白样品调至等浓度后上样。取出上样样品至0 测完蛋白含量后，所有蛋白样品调至等浓度后上样。取出上样样品至0.5ml离心管中，加入5×SDS 上样缓冲液至终浓度为1×。（上样总体积一般不超过15l，加样孔的最大限度可加20l样品。）上样前要将样品于沸水中煮5min使蛋白变性。加足够的电泳液后开始准备上样。用微量进样器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。加入下一个样品时，进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤3次，以免交叉污染

电泳时间一般1-2 h，电压为100V较好，也可用60V。电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳。

取出转移槽

取下玻璃板

两块玻璃板都已经取下

要先将玻璃板撬掉才可剥胶，撬的时候动作要轻，要在两个边上轻轻的反复撬。撬一会儿玻璃板便开始松动，直到撬去玻板。（撬时一定要小心，玻板很易裂。）

将浓缩胶（浓缩胶影响操作）和分离胶上不用的部分切去

在加有转移液的搪瓷盘里放入转膜用的夹子、两块海绵垫、一支玻棒、滤纸和浸过的膜，将夹子打开使白的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫，用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡 。

在垫子上垫三层滤纸（可三张纸先叠在一起在垫于垫子上），一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中的气泡。依次加膜、加胶，再在膜上盖3张滤纸并除去气泡。

最后盖上另一个海绵垫，擀几下就可合起夹子。整个操作在转移液中进行，要不断的擀去气泡。膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路。转移液含甲醇，操作时要戴手套，实验室要开门以使空气流通。

合起夹子

将夹子放入转移槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。

电转移时会产热，在槽的一边放一块冰来降温。

加上转移缓冲液

盖上盖子,放入乘有水的水槽中,水槽中加冰袋

电转移200mA 2-3h后，打开盖子，取出夹子

打开夹子，取出膜，如果所用marker是预染marker,可见marker已经转移到膜上,如果不是预染marker，可以把膜转完后将膜用1×丽春红染液染5min，于脱色摇床上摇，然后用水冲洗掉没染上的染液就可看到膜上的蛋白。 将膜晾干备用。

将膜用TBS从下向上浸湿后，移至含有封闭液的平皿中

室温下脱色摇床上摇动封闭1h。

按所需稀释浓度滴加一抗（直接加在封闭液里）4℃ 过夜或37℃ 3h。

第二天取出膜，用TBST洗三次每次10min 加入TBS液中，按稀释浓度滴加二抗，室温孵育1h TBST洗三次每次10min DAB显色或者化学发光法显影。

Western blot 实验流程 ECL显色：ECL试剂与过氧化物酶结合后发光后，可用仪器自动检测或在暗室内用X-光片将其记录下来。

Western blot 实验结果与分析 将X-光片在凝胶图像分析仪上进行灰度扫描，比较目的蛋白与内参照蛋白的灰度值，可得到蛋白表达半定量分析结果 c-fos actin 62kD 42kD