The biochemistry and molecular biology department of CMU 第 三 篇 基因信息的传递 The biochemistry and molecular biology department of CMU

基 因 (gene)： 为蛋白质或RNA编码的DNA功能片段，是以碱基排列顺序的方式储存的遗传信息。 基 因 组（genome)： 某一物种拥有的全部遗传物质，从分子意义上说，是指全部DNA序列。

* 中心法则(the central dogma) 转录 翻译 复制 DNA RNA 蛋白质 逆转录 转录 翻译 复制 DNA RNA 蛋白质 逆转录 转录 翻译 复制 DNA RNA 蛋白质 逆转录 转录 翻译 复制 DNA RNA 蛋白质 逆转录 转录 翻译 复制 DNA RNA 蛋白质 逆转录 转录 翻译 复制 DNA RNA 蛋白质 逆转录

主要内容 ● RNA的生物合成 —— 转录 ● 蛋白质的生物合成 —— 翻译 ● 基因表达调控 ● 基因重组与基因工程 ● DNA的生物合成 —— 复制 ● RNA的生物合成 —— 转录 ● 蛋白质的生物合成 —— 翻译 ● 基因表达调控 ● 基因重组与基因工程

DNA Biosynthesis (Replication) 第 十 章 DNA的生物合成 (复制) DNA Biosynthesis (Replication)

DNA的生物合成 复制(replication)： 以母链DNA为模板合成子链DNA的过程。 复制 逆转录 复制 子代DNA 亲代DNA

本章主要内容： • 复制的基本规律 • DNA复制的酶学和拓扑学变化 • 复制的过程 • 逆转录和其他复制方式 • DNA损伤(突变)与修复

Basic Rules of DNA Replication 第一节 复制的基本规律 Basic Rules of DNA Replication

DNA复制的特征 半保留复制 (semi-conservative replication) 双向复制 (bidirectional replication) 半不连续复制 (semi-discontinuous replication) 方向性和高保真性

一、半保留复制的实验依据和意义 半保留复制的概念 DNA生物合成时，母链DNA解开为两股单链，各自作为模板(template)按碱基配对规律，合成与模板互补的子链。子代细胞的DNA，一股单链从亲代完整地接受过来，另一股单链则完全重新合成。两个子细胞的DNA都和亲代DNA碱基序列一致。这种复制方式称为半保留复制。

DNA复制的三种可能方式 全保留式 　半保留式 混合式

DNA半保留复制实验 梯度离心结果 含N15-DNA的细菌 培养于普通培养液 第一代 继续培养于普通培养液 第二代

半保留复制的意义 按半保留复制方式，子代DNA与亲代DNA的碱基序列一致，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的保守性。 遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但不是绝对的。

二、双向复制 原核生物： • 基因组是环状DNA • 只有一个复制起始点 复制时，DNA从起始点(origin)向两个方向解链，形成两个延伸相反的复制叉，称为双向复制。

复制时双链打开，分开成两股，各自作为模板，子链沿模板延长所形成的Y字形的结构称为复制叉(replication fork) 。

复制中的放射自显影图象 ori 在原核生物双向复制中，DNA被描述为眼睛状。为说明方便而做的图为形。

oriC

真核生物： • 染色体DNA有多个复制起始点。 • 两个起始点之间的DNA片段称为复制子(replicon)。 • 复制子是独立完成复制的功能单位。

真核生物多个复制起始点、复制子与复制叉

真核生物的多复制子复制电镜图

三、复制的半不连续性 解链方向 3 5 5´ 领头链 (leading strand) 3´ 5´ 随从链 (lagging strand) 3´ 5´

顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的这股链称为领头链。 另一股链因为复制的方向与解链方向相反，不能顺着解链方向连续延长，这股不连续复制的链称为随从链。 领头链连续复制而随从链不连续复制，就是复制的半不连续性。

冈崎片段： • 原核生物: 1000~2000个核苷酸 • 真核生物: 100~200个核苷酸 • 1968年日本生化学者冈崎用电镜及放射自显影技术，观察到DNA复制中出现一些不连续的片段，将这些不连续的片段称为冈崎片段。 • 原核生物: 1000~2000个核苷酸 • 真核生物: 100~200个核苷酸

半不连续复制动画

The Enzymology of DNA Replication 第二节 DNA复制的酶学 The Enzymology of DNA Replication

DNA复制的体系 底物: dNTP (dATP、dGTP 、dCTP 、dTTP) 聚合酶: 依赖DNA的DNA聚合酶(DNA-pol) 引物: 提供3'-OH末端的寡核苷酸 其他酶和蛋白质因子: 拓扑异构酶、解螺旋酶、单链DNA结合蛋白、引物酶、连接酶

一、复制的化学反应 (dNMP)n + dNTP → (dNMP)n+1 + PPi

聚合反应的特点 DNA 新链生成需引物和模板； 新链的延长只可沿5 → 3方向进行 。

二、DNA聚合酶 活性：1. 53 的聚合活性 2. 核酸外切酶活性 全称：依赖DNA的DNA聚合酶 (DNA-dependent DNA polymerase) 简称：DNA-pol 活性：1. 53 的聚合活性 2. 核酸外切酶活性

奥乔亚 科恩伯格 Severo Ochoa Arthur Kornberg 1959 年获诺贝尔生理学或医学奖

3 5 3 5 聚合反应机理

聚合反应的特点 • 以单链DNA为模板 • 以dNTP为原料 • 引物提供3'-OH • 聚合方向为5' →3' • 遵守碱基互补规律

? 核酸外切酶活性 3  5外切酶活性 能辨认错配的碱基对，并将其水解。 5  3外切酶活性 能切除引物和突变的 DNA片段。 5´ A G C T T C A G G A T A  3´ | | | | | | | | | | | 3´ T C G A A G T C C T A G C G A C 5´ ? 3  5外切酶活性 能辨认错配的碱基对，并将其水解。 5  3外切酶活性 能切除引物和突变的 DNA片段。

（一）原核生物的DNA聚合酶 • DNA-pol Ⅱ • DNA-pol Ⅲ • DNA-pol Ⅳ • DNA-pol Ⅴ

E. Coli中的DNA聚合酶 pol I pol II pol III 5 聚合酶活性 + + +  5外切酶活性 + + 5 外切酶活性 + － － 亚基数 1 1 10 分子数/细胞 400 40 20 功能 校读、修复合成、切除引物填补空隙 参与DNA损伤的应急状态修复 催化DNA聚合

DNA-pol Ⅰ 功能：校读，去除RNA引物，填补空隙，参与DNA损伤修复。

N 端 DNA-pol Ⅰ C 端 木瓜蛋白酶 小片段 大片段/Klenow 片段 323个氨基酸 604个氨基酸 5  核酸外切酶活性 DNA聚合酶活性   5 核酸外切酶活性 Klenow片段是实验室合成DNA，进行分子生物学研究中常用的工具酶。

DNA聚合酶II (DNA-pol II) • 具有5′→3′的聚合酶活性。 • 只是在无polⅠ及polⅢ的情况下暂时 起作用。 • 对模板的特异性不高, 参与DNA损伤 的应急状态修复。

DNA聚合酶III (DNA-pol III) 是复制延长中真正起催化作用的酶。 由10种亚基组成不对称的聚合体。 α，ε，θ亚基组成核心酶，α亚基具有5'→3'的聚合活性，ε亚基具有3'→5'外切酶活性， θ亚基可能起组装作用。

β亚基(DNA夹子)能夹稳模板链，负责酶沿DNA模板滑动的作用。

DNA-pol Ⅲ

（二）真核生物的DNA聚合酶 DNA-pol  起始引发，有引物酶活性。 DNA-pol  参与低保真度的复制。 DNA-pol  复制的主要酶，有解螺旋酶活性。 DNA-pol  在复制过程中起校读、修复和填补缺口的作用。

三、复制保真性的酶学依据 复制按照碱基配对规律进行，是遗传信息能准确传代的基本原理。 复制保真性的酶学机制： （一）DNA-pol的核酸外切酶活性和即时校读 （二）复制的保真性和碱基选择

（一）DNA-pol的核酸外切酶活性和即时校读

（二）复制的保真性和碱基选择 • DNA聚合酶靠其大分子结构协调非共价（氢键）与共价（磷酸二酯键）键的有序形成。 • 嘌呤的化学结构能形成顺式和反式构型，与相应的嘧啶形成氢键配对，嘌呤应处于反式构型。

DNA复制的保真性至少要依赖三种机制 1. 遵守严格的碱基配对规律； 2. 聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能； 3. 复制出错时DNA-pol的即时校读功能。

四、复制中的分子解链及DNA 分子拓扑学变化 DNA分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把DNA解成单链，它才能起模板作用。

（一）解螺旋酶、引物酶和单链DNA结合蛋白 理顺 DNA 链 拓扑异构酶 ( gyrA , B) 稳定已解开的单链 单链 结合蛋白 SSB 催化 RNA 引物生成 引物酶 DnaG dnaG ) 运送和协同 DnaB DnaC dnaC 解开 双链 解螺旋酶 dnaB 辨认起始点 DnaA dnaA 蛋白质（基因） 通用名 功能 原核生物复制起始的相关蛋白质

E. Coli 基因图

解螺旋酶(helicase)又称解链酶或rep蛋白 利用ATP供能，作用于氢键，使DNA双链解开成为两条单链。 Dna B Dna C 解链方向

单链DNA结合蛋白 (single stranded DNA binding protein, SSB) 在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整性。

DNA拓扑异构酶(DNA topoisomerase) 拓扑是指物体或图像作弹性位移而又保持不变的性质。 局部解链后 10 8

解链过程中，DNA分子会过度拧紧、打结、缠绕、连环等现象。

拓扑异构酶作用特点 既能水解 、又能连接磷酸二酯键 克服解链过程中的打结、缠绕现象 分 类 拓扑异构酶Ⅰ 拓扑异构酶Ⅱ

作用机制 切断DNA双链中一股链，使DNA解链旋转不致打结；适当时候封闭切口，DNA变为松弛状态。 拓扑异构酶Ⅰ 反应不需ATP。 利用ATP供能，连接断端， DNA分子进入负超螺旋状态。（主要） 拓扑异构酶Ⅱ

拓扑异构酶Ⅰ的作用

拓扑异构酶Ⅱ的作用

解旋解链酶类的作用

引物酶(primase) 引物（primer）： 是由引物酶催化生成的短链RNA，它可为DNA聚合提供3'-OH末端。 依赖DNA的RNA聚合酶。 对利福平不敏感。 可以催化游离NTP聚合。 在大肠杆菌，是dna G 基因的表达产物。 催化RNA引物的生成。 引物（primer）： 　 是由引物酶催化生成的短链RNA，它可为DNA聚合提供3'-OH末端。

五、DNA连接酶 连接DNA链3-OH末端和相邻DNA链5-P末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连接成一条完整的链。

5’ 3’ 3’ HO 5’ ATP（NAD+） DNA连接酶 AMP 5’ 3’ 3’ 5’

DNA连接酶的功能 在复制中起接合双链中单链缺口的作用。 在DNA修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。 是基因工程的重要工具酶之一。

The Process of DNA Replication 第三节 DNA生物合成过程 The Process of DNA Replication

一、原核生物的DNA生物合成 （一）复制的起始 需要解决两个问题： 1. DNA解开成单链，提供模板。 2. 合成引物，提供3-OH末端;形成引发体。

1. DNA解链 5 3 3 5 串联重复序列 反向重复序列 E.coli复制起始点 oriC 1 13 17 29 32 44 1 13 17 29 32 44 GATTNTTTATTT ··· GATCTNTTNTATT ··· GATCTCTTATTAG ··· 5 3 3 5 58 66 166 174 201 209 237 245 串联重复序列 反向重复序列 ···TGTGGATTA-‖-TTATACACA-‖-TTTGGATAA-‖-TTATCCACA E.coli复制起始点 oriC

2. 引发体和引物 含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为引发体。 Dna B、 Dna C 3 Dna A 5 3 DNA拓扑异构酶 SSB 5 含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为引发体。

引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子。 3 引物酶 3' HO 5' 引物 5 3 5 引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子。

DNA解成单链 由拓扑异构酶松弛超螺旋，解螺旋酶 解开双链，SSB结合到单链上使其稳定。

（二）复制的延长 复制的延长指在DNA-pol催化下，dNTP以dNMP的方式逐个加入引物或延长中的子链上，其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。

5' 3' DNA-pol 5' OH 3' 3' dATP dGTP dTTP dCTP

领头链的合成

随从链的合成

复制过程简图

复 制 过 程 动 画

（三）复制的终止 ori E.coli ori ter ter 原核生物基因是环状DNA，双向复制的复制片段在复制的终止点(ter)处汇合。 SV40 ori 82 32 ter 50 ter

随从链上不连续性片段的连接 5 RNA酶 5 DNA-pol Ⅰ dNTP 5 ATP DNA连接酶 AMP+PPi 5 OH P

二、真核生物的DNA生物合成 哺乳动物的细胞周期 DNA合成期 G1 G2 S M 哺乳动物的细胞周期 DNA合成期 • 细胞能否分裂，决定于进入S期及M期这两个关键点。G1→S及G2→M的调节，与蛋白激酶活性有关。 • 蛋白激酶通过磷酸化激活或抑制各种复制因子而实施调控作用。

（一）复制的起始 • 真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子复制。复制有时序性，即复制子以分组方式激活而不是同步起动。 • 复制的起始需要DNA-polα（引物酶活性）和polδ（解螺旋酶活性）参与。还需拓扑酶和复制因子(replication factor, RF)。

•增殖细胞核抗原(proliferation cell nuclear antigen, PCNA)在复制起始和延长中起关键作用。 •酵母DNA复制起始点为11bp富含AT的核心序列。 •复制起始包括打开复制叉、形成引发体和合成RNA引物。

（二）复制的延长 3 5 亲代DNA 领头链 5 3 5 3 随从链 3 引物 5 核小体

（三）复制的终止和端粒酶 DNA复制与核小体装配同步进行。 染色体DNA呈线状，复制在末端停止。 复制终止包括： 岡崎片段、复制子之间的连接。 端粒的合成

真核生物端粒的形成： 端粒（telomere）是指真核生物染色体线性DNA分子末端的结构部分，通常膨大成粒状。

• 末端DNA序列是多次重复的富含G、T碱基的短序列。 结构特点 • 由末端DNA序列和蛋白质构成。 • 末端DNA序列是多次重复的富含G、T碱基的短序列。 TTTTGGGGTTTTGGGG… 功能 • 维持染色体的稳定性 • 维持DNA复制的完整性

端粒酶(telomerase) 线性DNA在复制完成后，其末端由于引物RNA的水解而可能出现缩短。故需要在端粒酶（telomerase）的催化下，进行延长反应。

端粒酶(telomerase) 端粒酶的分子结构 端粒酶是一种RNA-蛋白质复合体，它可以其RNA为模板，通过逆转录过程对末端DNA链进行延长。 端粒酶的分子结构

端粒酶的组成 端粒酶RNA (human telomerase RNA, hTR) 端粒酶协同蛋白 (human telomerase associated protein 1, hTP1) 端粒酶逆转录酶 (human telomerase reverse transcriptase, hTRT)

端粒酶的爬行模型（动画演示）

DNA聚合酶复制子链 进一步加工

端粒及端粒酶的意义 成年人端粒比胚胎细胞端粒短； 老化与端粒酶活性下降有关； 肿瘤的发生与端粒酶活性有关； 端粒酶不一定能决定端粒的长度。

细胞衰老 细胞分裂 细胞分裂 端粒酶 永生化 抗肿瘤靶点

正常细胞： 细胞年轻化 细胞分裂 抗衰老 细胞分裂 衰老死亡 端粒酶 重新引入

Reverse Transcription and Other DNA Replication Ways 第四节 逆转录和其他复制方式 Reverse Transcription and Other DNA Replication Ways

一、逆转录病毒和逆转录酶 RNA DNA 逆转录 (reverse transcription)

逆转录酶 (reverse transcriptase) 从RNA病毒中发现，能催化以RNA为模板合成双链DNA的酶，全称为依赖RNA的DNA聚合酶。 有三种活性：RNA指导的DNA聚合活性 RNase H活性 　　　　　　 DNA指导的DNA聚合活性

逆转录病毒细胞内的逆转录现象 RNA 模板 逆转录酶 DNA-RNA 杂化双链 RNA酶 单链DNA 双链DNA

试管内合成cDNA cDNA complementary DNA 以mRNA为模板，经逆转录合成的与mRNA碱基序列互补的DNA链。 AAAA 逆转录酶 A AA A T T T T cDNA complementary DNA 以mRNA为模板，经逆转录合成的与mRNA碱基序列互补的DNA链。 碱水解 T T T T DNA聚合酶Ⅰ 分子生物学研究可应用逆转录酶，作为获取基因工程目的基因的重要方法之一，此法称为cDNA法。 SI核酸酶

二、逆转录研究的意义 逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究中的重大发现。 逆转录现象说明：至少在某些生物，RNA同样兼有遗传信息传代与表达功能。 对逆转录病毒的研究，拓宽了20世纪初已注意到的病毒致癌理论。

三、滚环复制和D环复制 是某些低等生物的复制形式，如X174和M13噬菌体等。 滚环复制(rolling circle replication) 是某些低等生物的复制形式，如X174和M13噬菌体等。

滚环复制

滚环复制动画

D环复制(D-loop replication) 是线粒体DNA (mitochondrial DNA，mtDNA) 的复制形式。 由DNA聚合酶-g催化。 两条链的复制起点的位置不同。

D环复制 L链 H链

DNA Damage (Mutation) and Repair 第五节 DNA损伤（突变）与修复 DNA Damage (Mutation) and Repair

是由遗传物质结构改变而引起的遗传信息的改变。从分子水平来看，突变就是DNA分子上碱基的改变。 突变 (mutation)： 是由遗传物质结构改变而引起的遗传信息的改变。从分子水平来看，突变就是DNA分子上碱基的改变。 DNA损伤 (DNA damage)： 泛指一切DNA结构和功能的变化。包括各种突变类型、碱基的损伤和DNA链的断裂。 双螺旋结构的异常扭曲-----对DNA复制或转录可产生生理性伤害。

一、突变的意义 （一）突变是进化、分化的分子基础 （二）突变导致基因型改变 （三）突变导致死亡 （四）突变是某些疾病的发病基础

二、引发突变的因素 自发性: 自然错配率约为10-9～10-10 左右。 物理因素: 如UV (ultra violet)、各种辐射。 自发性: 自然错配率约为10-9～10-10 左右。 物理因素: 如UV (ultra violet)、各种辐射。 化学因素: 烷化剂、碱基类似物、以及其他一些人工合成或环境中存在的化学物质，这些诱发突变的化学物质,称为致癌剂。 生物因素: 抗菌素类、黄曲霉素和病毒等。

物理因素

化学因素 常见的化学诱变剂 化合物类别 作 用 点 分子改变 碱基类似物 - A - ® - G - A 5 - BU ® G 如： 5 - T - - C - - T - NH OH - C - 羟胺类（ ） T ® C 2 - A - - G - - G - - A - 亚硝酸盐（ NO ） C ® U 2 - C - - T - 烷化剂 m m G G ® ® G G DNA 缺失 G 如：氮芥类， Nitromins

三、突变的分子改变类型 错配 (mismatch) 缺失 (deletion) 插入 (insertion) 重排 (rearrangement) 框移 (frame-shift)

（一）错配 DNA分子上的碱基错配称点突变 (point mutation) 1. 转换 发生在同型碱基之间，即嘌呤代替另一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。 1. 转换 发生在异型碱基之间，即嘌呤变嘧啶或嘧啶变嘌呤。 2. 颠换

正常成人Hb (HbA)β亚基 镰形红细胞贫血病人Hb (HbS) β亚基 N-val · his · leu · thr · pro · glu · glu · · · · · · C 肽链 CTC GAG 基因 镰形红细胞贫血病人Hb (HbS) β亚基 N-val · his · leu · thr · pro · val · glu · · · · · · C 肽链 CAC GTG 基因

1949年波林发现镰刀型细胞贫血症（病人的红血细胞为镰刀形）与血红蛋白结构异常相关。

（二）缺失、插入和框移 缺失：一个碱基或一段核苷酸链从DNA大分子上消失。 插入：原来没有的一个碱基或一段核苷酸链插入到DNA大分子中间。 缺失或插入都可导致框移突变 。 框移突变是指三联体密码的阅读方式改变，造成蛋白质氨基酸排列顺序发生改变。

缺失引起框移突变 正常 缺失C 5’ ……G C A G U A C A U G U C …… 丙 缬 组 缬 谷 酪 蛋 丝 5’ ……G C A G U A C A U G U C …… 丙 缬 组 缬 正常 5’ ……G A G U A C A U G U C …… 缺失C

（三）重排 DNA分子内较大片段的交换，称为重组或重排。

由基因重排引起的两种地中海贫血基因型

四、DNA损伤的修复 修复(repairing) 修复的主要类型 是对已发生分子改变的补偿措施，使其回复为原有的天然状态。 光修复(light repairing) 切除修复(excision repairing) 重组修复(recombination repairing) SOS修复

（一）光修复 光修复酶

（二）切除修复 是细胞内最重要和有效的修复机制，主要由DNA-polⅠ和连接酶完成。 E.coli的切除修复机制 UvrC UvrA UvrB 是细胞内最重要和有效的修复机制，主要由DNA-polⅠ和连接酶完成。 OH P DNA聚合酶Ⅰ OH P E.coli的切除修复机制 DNA连接酶 NAD+

切除修复动画

切除修复对多种DNA损伤起修复作用： • 碱基脱落形成的无碱基位点 • 嘧啶二聚体 • 碱基烷基化 • 单链断裂 • 碱基错配 • 庞大的化学附加物 • 链间交联

着色性干皮病(xeroderma pigmentosis，XP) 是切除修复缺陷性的遗传病。 XP病人细胞对嘧啶二聚体和烷基化的清除能力降低，不能修复紫外线照射引起的DNA损伤，因此易发生皮肤癌。

（三）重组修复

（四）SOS修复 当DNA损伤广泛难以继续复制时，由此而诱发出一系列复杂的反应。 在E. coli，各种与修复有关的基因，组成一个称为调节子(regulon)的网络式调控系统。 这种修复特异性低，对碱基的识别、选择能力差。通过SOS修复，复制如能继续，细胞是可存活的。然而DNA保留的错误较多，导致较广泛、长期的突变。