转录组学 01/15, 2017 ventson@zju.edu.cn Ming Chen’s Group of Bioinformatics @College of Life Science, Zhejiang University 转录组学 01/15, 2017 ventson@zju.edu.cn

前言 基因组学 转录组学 蛋白质组学 中心法则：遗传信息传递 Ming Chen’s Group of Bioinformatics @College of Life Science, Zhejiang University 前言 基因组学 转录组学 蛋白质组学 from en.wikipedia 中心法则：遗传信息传递

技术发展 NGS 转录组学研究技术革新 SAGE CAGE MPSS Ming Chen’s Group of Bioinformatics @College of Life Science, Zhejiang University 技术发展 Experiment-based Northern blot RT-PCR Hybridization-based Microarray Sequencing-based SAGE CAGE MPSS Advanced seq NGS 3GS Single cell 转录组学研究技术革新

差异表达 可变剪切 共表达 转录调控 应用 Ming Chen’s Group of Bioinformatics @College of Life Science, Zhejiang University 应用 差异表达 可变剪切 共表达 转录调控

RNA测序（RNA-sequencing） Ming Chen’s Group of Bioinformatics @College of Life Science, Zhejiang University RNA测序（RNA-sequencing） from GATC Biotech 1.试验设计 2.测序流程 3.数据分析 4.验证实验

试验设计 问题导向型 数据导向型 生物学重复（3-5个） 样本提取（分类和保存） 数据异质性（平台、个体差异） 确定分析流程 分析工具选用 Ming Chen’s Group of Bioinformatics @College of Life Science, Zhejiang University 试验设计 问题导向型 生物学重复（3-5个） 样本提取（分类和保存） 测序深度（简单基因表达分析需5M以上reads，小RNA至少30M） 文库构建（链特异性非特异性） 测序策略（单端和双末端） 测序平台（读长、通量和准确率等） 数据导向型 数据异质性（平台、个体差异） 确定分析流程 分析工具选用

测序流程 Ming Chen’s Group of Bioinformatics mRNA：Poly A富集 ncRNA：rRNA移除 @College of Life Science, Zhejiang University 测序流程 mRNA：Poly A富集 ncRNA：rRNA移除 Griffith, M. (2015) PLoS computational biology

数据分析流程 RNA-seq数据分析常规流程 系统配置 数据获取 质量控制 比对组装 表达定量 差异表达 聚类分析 功能富集 共表达网络 Ming Chen’s Group of Bioinformatics @College of Life Science, Zhejiang University 数据分析流程 系统配置 数据获取 质量控制 比对组装 表达定量 差异表达 聚类分析 功能富集 共表达网络 RNA-seq数据分析常规流程

系统配置 Ming Chen’s Group of Bioinformatics @College of Life Science, Zhejiang University 系统配置

数据获取 NCBI SRA TCGA/GDC(cancer) EBI ArrayExpress 公共数据库 测序公司 Fastq文件格式： Ming Chen’s Group of Bioinformatics @College of Life Science, Zhejiang University 数据获取 NCBI SRA TCGA/GDC(cancer) EBI ArrayExpress fastq-dump (SRAToolkit) 公共数据库 测序公司 Fastq文件格式：

质量控制 FastQC—测序质量评估 FASTX-Toolkit，Trimmomatic—质量控制 Ming Chen’s Group of Bioinformatics @College of Life Science, Zhejiang University 质量控制 去接头；过滤低质量reads FastQC—测序质量评估 FASTX-Toolkit，Trimmomatic—质量控制

比对（reads mapping） 非剪接比对—Bowtie，BWA （不考虑可变剪切） Ming Chen’s Group of Bioinformatics @College of Life Science, Zhejiang University 比对（reads mapping） 非剪接比对—Bowtie，BWA （不考虑可变剪切） 剪接比对—TopHat，STAR，HISAT/GSNAP，MapSplice(SNP) TopHat工作原理 Trapnell, C. (2009) Bioinformatics

比对结果 比对结果文件—SAM（SAMtools） 比对结果可视化—IGV (local) Ming Chen’s Group of Bioinformatics @College of Life Science, Zhejiang University 比对结果 比对结果文件—SAM（SAMtools） 比对结果可视化—IGV (local) 比对结果评估—Qualimap (summary)

表达定量 Reads counting Normalization Ming Chen’s Group of Bioinformatics @College of Life Science, Zhejiang University 表达定量 Reads counting 只保留唯一匹配reads —HTSeq-count，featureCounts 保留多重匹配reads —Cufflinks，StringTie，RSEM Normalization RPKM，FPKM，TPM —校正测序深度、基因长度 DESeq/edgeR(TMM) —校正异常高表达基因

比对组装策略选择 Ming Chen’s Group of Bioinformatics @College of Life Science, Zhejiang University 比对组装策略选择 Conesa, A. (2016) Genome Biology

差异表达分析 选取样本：样本相关性，大样本降维（主成分分析） 模型选择：高斯分布（正态），泊松分布（v=μ），负二项分布（v=μ+αμ2） Ming Chen’s Group of Bioinformatics @College of Life Science, Zhejiang University 差异表达分析 选取样本：样本相关性，大样本降维（主成分分析） 模型选择：高斯分布（正态），泊松分布（v=μ），负二项分布（v=μ+αμ2） 差异检验：组间差异（处理差异）— 组内差异（个体差异）?= 0 筛选条件：p value（多重检验校正） & FoldChange（差异倍数） 工具 版本 标准化方式 模型假设 统计检验 edgeR 3.18.1 TMM/Upper quartile/RLE 负二项分布 Exact test DESeq2 1.16.1 DESeq sizeFactors Wald test/LRT baySeq 2.10.0 quantile/TMM/total empirical Bayesian NOIseq 2.20.0 RPKM/TMM/Upper quartile 非参数 Condition vs. null Limma 3.32.10 TMM voom 转换 Empirical Bayes Cuffdiff2 2.2.1 Geometric/quartile/FPKM β负二项分布 t-test EBSeq 1.16.0 DESeq median normalization 常用差异表达分析工具比较

聚类分析 基因表达聚类结果（pheatmap） Ming Chen’s Group of Bioinformatics @College of Life Science, Zhejiang University 聚类分析 单基因分析 vs. 基因模块分析 常用聚类方法：K-means（K均值），层次聚类，SOM（自组织映射），FCM（模糊C均值） 基因表达聚类结果（pheatmap）

富集分析 基因集 功能集 常用工具：DAVID，agriGO，GSEA，IPA，clusterProfiler GSEA原理 超几何分布 Ming Chen’s Group of Bioinformatics @College of Life Science, Zhejiang University 富集分析 GO/KEGG 基因集 功能集 常用工具：DAVID，agriGO，GSEA，IPA，clusterProfiler GSEA原理 Subramanian, A. (2005) PNAS 表达量-样本相关性排序，功能基因集分布，计算富集得分 超几何分布 特定功能集S 不属于功能集S 总基因数 目标基因 x k-x k 背景基因 M N-M N Fisher精确检验

共表达网络 基因集 基因网络 不同样本表达模式相似的基因功能应该也类似 根据表达量计算相关性矩阵，构建共表达网络 Ming Chen’s Group of Bioinformatics @College of Life Science, Zhejiang University 共表达网络 基因集 基因网络 不同样本表达模式相似的基因功能应该也类似 相互作用 根据表达量计算相关性矩阵，构建共表达网络 Interaction，相关性系数：Pearson，Spearman 无标度网络  WGCNA权重基因共表达网络分析 核心基因（Hub genes） MCODE网络模块挖掘（子网络） CytoScape网络可视化

验证试验 PCR，凝胶电泳 相关性 因果关系 基因敲除，敲减，过表达 Ming Chen’s Group of Bioinformatics @College of Life Science, Zhejiang University 验证试验 PCR，凝胶电泳 相关性 因果关系 基因敲除，敲减，过表达

拓展 全长转录本（三代测序） 技术革新 单细胞测序（single cell） 整合应用 多组学整合：基因组，表观组，蛋白组，代谢组，表型组 Ming Chen’s Group of Bioinformatics @College of Life Science, Zhejiang University 拓展 全长转录本（三代测序） 技术革新 单细胞测序（single cell） 多组学整合：基因组，表观组，蛋白组，代谢组，表型组 非编码：lncRNA，circRNA 表观转录组：m6A修饰 整合应用

操作实践 核心分析 转录组核心数据分析在linux系统中完成（内存、时间），具体步骤可参考《生物信息学》第3版书籍及视频教程 Ming Chen’s Group of Bioinformatics @College of Life Science, Zhejiang University 操作实践 转录组核心数据分析在linux系统中完成（内存、时间），具体步骤可参考《生物信息学》第3版书籍及视频教程 核心分析 表达量矩阵：基因X样本

操作实践 统计分析及可视化 1.软件安装 2.差异分析 3.聚类分析 4.功能富集 Ming Chen’s Group of Bioinformatics @College of Life Science, Zhejiang University 操作实践 统计分析及可视化 1.软件安装 2.差异分析 3.聚类分析 4.功能富集

软件安装 CRAN #从cran安装pheatmap，ggplot2 chooseCRANmirror() Ming Chen’s Group of Bioinformatics @College of Life Science, Zhejiang University 软件安装 http://www.bioconductor.org/ DESeq2（差异表达分析） ggplot2（作图） pheatmap（聚类可视化） CRAN #从cran安装pheatmap，ggplot2 chooseCRANmirror() install.packages(“pheatmap”) library(pheatmap) install.packages(“ggplot2”) library(ggplot2) #从bioconductor安装DESeq2 chooseBioCmirror() #China Anhui source("http://www.bioconductor.org/biocLite.R") biocLite("DESeq2") library(DESeq2)

差异分析 #数据预处理 setwd(“F:/rnaseq/data”) #设置工作目录（根据自己存放数据的目录修改） Ming Chen’s Group of Bioinformatics @College of Life Science, Zhejiang University 差异分析 #数据预处理 setwd(“F:/rnaseq/data”) #设置工作目录（根据自己存放数据的目录修改） library(DESeq2) #载入DESeq2包 #reads计数数据表操作 countTable <- read.table("count.txt", sep = "\t", header = FALSE) #读入reads计数矩阵 tail(countTable) #查看数据表最后的“小尾巴” countTable <- countTable[- c(33611:33615), ] #去除描述行 rownames(countTable) <- countTable$V1 #将基因ID设置为行名 countTable <- countTable[, - 1] #删除基因ID列 colnames(countTable) <- c("SRR3418005", "SRR3418006", "SRR3418019", "SRR3418020") #更改数据表列名 countTable <- countTable[- which(rowSums(countTable) < 4), ] #过滤count总数小于4的基因 nrow(countTable) #查看数据表行数（基因个数） tail(countable) #查看修改后的数据表末尾六行 #设置样本处理信息（实验 vs. 对照） colData <- data.frame(row.names = colnames(countTable), condition = c("ABA", "mock", "ABA", "mock"))

差异分析 #DESeq2操作 #生成DESeqDataSet数据集 Ming Chen’s Group of Bioinformatics @College of Life Science, Zhejiang University 差异分析 #DESeq2操作 #生成DESeqDataSet数据集 dds <- DESeqDataSetFromMatrix(countData = countTable, colData = colData, design = ~ condition) dds #查看数据集 dds$condition #查看样本处理信息 dds$condition <- relevel(dds$condition, "mock") #更改mock水平（使DESeq计算FoldChange时mock组作为分母） dds$condition #查看更改水平后的样本处理信息 dds <- DESeq(dds) #差异表达计算 res <- results(dds) #生成差异表达结果 summary(res) #查看总结信息（表达上调，下调等） resOrdered <- res[order(res$padj), ] #按照校准后p值排序 write.csv(resOrdered, "DESeq2_results_all.csv") #将差异表达分析结果输出到csv文件 deg <- subset(resOrdered, padj <= 0.01 & abs(log2FoldChange) >= 2) #筛选显著差异表达基因（padj小于0.01且FoldChange绝对值大于4） summary(deg) #查看筛选后的总结信息 write.csv(deg, "DESeq2_results_significant.csv") #将差异表达显著的结果输出到csv文件

差异分析 #volcano plot火山图 setwd("F:/rnaseq/data") library(ggplot2) Ming Chen’s Group of Bioinformatics @College of Life Science, Zhejiang University 差异分析 #volcano plot火山图 setwd("F:/rnaseq/data") library(ggplot2) volcano_data <- read.csv("DESeq2_results_all.csv", row.names = "X") #读入差异表达结果 volcano_data <- na.omit(volcano_data) #删除含NA的行 significant <- as.factor(abs(volcano_data$log2FoldChange) >=2 & volcano_data$padj <= 0.01) #设置显著性阈值 ggplot(volcano_data, aes(x = log2FoldChange, y = - log10(padj))) + geom_point(aes(shape = significant, color = significant)) + xlim(c(-10, 10)) + labs(x = “log2FoldChange”, y = “-log10 padj”) + scale_y_continuous(limits = c(0, 20), expand = c(0, 0)) + scale_shape_discrete(labels =c (“no”, “yes”)) + scale_color_discrete(labels = c(“no”, “yes”)) #ggplot2命令

聚类分析 #heatmap聚类热图 setwd("F:/rnaseq/data") library(pheatmap) Ming Chen’s Group of Bioinformatics @College of Life Science, Zhejiang University 聚类分析 #heatmap聚类热图 setwd("F:/rnaseq/data") library(pheatmap) deseq_results_significant <- read.csv("DESeq2_results_significant.csv", row.names = "X") #读入显著差异表达结果 significant_genes <- rownames(deseq_results_significant) #提取显著差异基因 fpkm_gtf <- read.table("fpkm.gtf") #读入FPKM注释文件 fpkm_gtf <- fpkm_gtf[-which(fpkm_gtf$V2 == "-" | fpkm_gtf$V2 == "."), ] #删除Gene ID未知的行 rownames(fpkm_gtf) <- fpkm_gtf$V2 #将Gene ID设置为行名 fpkm_significant_genes <- fpkm_gtf[significant_genes, 9:12] #提取显著差异基因的FPKM值 colnames(fpkm_significant_genes) <- c("SRR3418005", "SRR3418006", "SRR3418019", "SRR3418020") #设置列名 fpkm_significant_genes <- na.omit(fpkm_significant_genes) #删除含NA值的行 pheatmap(log2(t(fpkm_significant_genes + 1)), show_colnames = FALSE) #所有差异基因热图 pheatmap(log2(t(fpkm_significant_genes[1:30, ] + 1))) #差异基因top30热图

功能富集 DAVID agriGO WEGO clusterProfiler MetaScape 物种覆盖较全；数据更新慢 植物基因富集专用 Ming Chen’s Group of Bioinformatics @College of Life Science, Zhejiang University 功能富集 DAVID 物种覆盖较全；数据更新慢 agriGO 植物基因富集专用 WEGO 富集结果可视化 clusterProfiler 实时抓取；富集方法全面；R语言 MetaScape 操作简单；可视化效果好；物种较少

DAVID使用 Ming Chen’s Group of Bioinformatics 点击开始分析 @College of Life Science, Zhejiang University DAVID使用 点击开始分析

DAVID使用 第一步：导入基因列表/文件 第四步：提交运行 第二步：选择ID类型 Ming Chen’s Group of Bioinformatics @College of Life Science, Zhejiang University DAVID使用 第一步：导入基因列表/文件 第三步：基因列表/背景 示例文件 第四步：提交运行 第二步：选择ID类型

DAVID使用 功能分析 Ming Chen’s Group of Bioinformatics 选择功能类型（GO，KEGG） @College of Life Science, Zhejiang University DAVID使用 选择功能类型（GO，KEGG） 功能分析

DAVID使用 功能聚类集 富集结果列表 Ming Chen’s Group of Bioinformatics @College of Life Science, Zhejiang University DAVID使用 功能聚类集 富集结果列表

MetaScape使用 提交运行 选择物种 上传基因 Ming Chen’s Group of Bioinformatics @College of Life Science, Zhejiang University MetaScape使用 上传基因 选择物种 提交运行

什么是转录组学？ RNA-seq的研究内容？ 如何分析RNA-seq数据？ 总结 Ming Chen’s Group of Bioinformatics @College of Life Science, Zhejiang University 总结 什么是转录组学？ RNA-seq的研究内容？ 如何分析RNA-seq数据？

谢谢！ 转录组分析 浙江大学生命科学学院 生物信息学实验室 http://bis.zju.edu.cn Ming Chen’s Group of Bioinformatics @College of Life Science, Zhejiang University 转录组分析 谢谢！ 浙江大学生命科学学院 生物信息学实验室 http://bis.zju.edu.cn