细胞与分子生物学实验 细胞与分子生物学教学实验室 776533分机

实验的目地 The goal of the lab course is to give you the opportunity to develop basic experimental skills through project based learning. Each laboratory experiment is designed to solve a problem and to allow you time to understand the material in greater depth. You will read scientific literature, design and modify procedures, analyze data and present conclusions.

实验课安全注意事项 做好个人防护（穿戴），禁止室内饮食； 实验过程中正确操作，仪器使用、试剂拿取等注意安全； 做好实验垃圾的分类、分置（有毒有害）； 别太在意结果，自己不一定做得出好的结果。 有自己的分析、思考必有加分。

实验课的要求 做好实验前的预习； 每个步骤知道怎么做，两人合作，规范操作。 实验结果分析和思考题巩固实验原理、试剂用途。 保持安静，禁止喧哗，不得做与实验无关的事情； 保持实验室的整洁，保持工作面的整洁； 禁止虐待小动物； 按时、认真完成实验报告； 独立思考、独立分析、独立完成实验报告；

课 程 安 排 9次实验操作（3次细胞+6次生化） 最后课程考试（实验操作考+实验理论考） 总分=平时操作、实验报告+课程考试成绩

实验成绩 总分=平时成绩（50%）+课程考试成绩（50%） 课程考试成绩：实验操作考+实验理论考 平时成绩： 9×（实验操作+实验报告）

细胞生物学实验 生物化学四大基本技术 分子生物学实验 1，2，3、（p80、实验25、实验27 ） 4、电泳技术（实验1） 5、蛋白质提取 6、层析技术（实验5、6） 7、分光光度法（p133） 离心法（实验9、10） 分子生物学实验 8，9、（ p111DNA提取、实验15）

显微镜的使用 细胞形态观察 《细胞培养技术》录像 实 验 一 显微镜的使用 细胞形态观察 《细胞培养技术》录像

光学显微镜基本结构 接口 目镜 物镜 推进器 载物台切片夹 聚光器 粗细调节 照明灯

物 镜 的 符 号 放大倍率指示色带： 红色—4X 黄色—10X 绿色—20X 浅蓝色—40X 蓝色—60X 白色—100X 生产厂家 色差矫正 （复消色差） 平场矫正 数值孔径 1.40 放大倍率 观察的介质 油镜 特殊观察方式 筒长 （无限远系统） 工作距离 0.21mm 放大倍率指示色带 蓝色—60倍 盖玻片厚度 (0.17mm) 弹簧物镜 保护装置

显微镜的使用及注意事项 用右手握住镜臂，左手托镜座--------双手拿 左眼看，右眼看纸绘图---------两眼都要用 物镜选用：低----高----油，必须在卡口上 目镜调节：由最低向上调，先粗后细 聚光镜光度调节，光圈的大小调节 放置玻片标本时,应注意标本的正反，把要观察的部分对准通光孔的正中央。 粗、细调节器都不能做单方向的旋转，如一直下降会压碎玻片标本。 显微镜用后，应转动粗调节器使载物台下降,取下玻片,并转动旋转盘,使物镜离开聚光镜,然后上升载物台使物镜接近镜台；目镜、物镜、反光镜等用擦镜纸擦拭干净。

作图要求 2~3个细胞即可 只用点和线表示深浅与明暗 线条光滑均匀，点圆而均匀 标注部分用直尺引出平行细线 注字一般置于右侧

植物细胞有丝分裂：洋葱根尖切片 前期：染色质→染色丝→染色体 中期：形成赤道板。 后期：着丝粒纵裂为二。 末期：出现细胞板、染色体解旋成染色质。

前期(prophase) 前期开始的第一个特征是染色质开始浓缩(condensation)形成染色体(chromosome） 第二个特征细胞骨架解聚，有丝分裂纺锤体(mitotic spindle)开始装配,高尔基体、内质网等细胞器解体，形成小的膜泡 形态最复杂，变化最丰富

中期(metaphase) 所有染色体排列到赤道板(Metaphase Plate)上,标志着细胞分裂已进入中期。

后期(anaphase) 排列在赤道面上的染色体的姐妹染色单体分离产生向极运动，着丝粒分散

末期(telophase) 染色单体到达两极，即进入了末期,到达两极的染色单体开始去浓缩。 核膜开始重新组装。 核仁也开始重新组装，RNA合成功能逐渐恢复。

荧光显微镜的使用 荧光显微镜的原理、构造       荧光显微镜与普通光学显微镜不同，它不是通过普通光源的照明观察标本，而是利用一定波长的光(通常是紫外光、蓝紫光)激发显微镜下标本内的荧光物质，使之发射荧光，所以，荧光显微镜的光源所起的作用不是直接照明，而是作为一种激发标本的内荧光物质的能源。我们之所以能观察标本，是由于在光源的照明下， 标本内荧光物质吸收激发的光能后所呈现的荧光现象。     由此可知，荧光显微镜的特点，主要是它的光源能供给大量特定波长范围的激发光，使受检标本内的荧光物质能获得必要强度的激发光。同时，荧光显微镜必须具备相应的滤光镜系统。 它是由超高压光源、滤片系统、光学系统和摄影系统等主要部件组成。

徕卡DMI3000B倒置荧光显微镜 （1）－投射电源开关 （2）－聚光器 （3）－载物台 （4）－物镜 （5）－调焦操纵轮 10 11 4 6 （1）－投射电源开关 （2）－聚光器 （3）－载物台 （4）－物镜 （5）－调焦操纵轮 （6）－透射光档片 （10）－载物台操纵轮 （11）－ CCD光路 活动杆

徕卡DMI3000B倒置荧光显微镜 （2）－聚光器 （3）－载物台 （4）－物镜 （5）－调焦操纵轮 （7）－荧光独立电源 8 9 （9）－荧光转盘 （7）－荧光独立电源 （8）－荧光光栅拉杆 （2）－聚光器 （3）－载物台 （4）－物镜 （5）－调焦操纵轮

徕卡DMI3000B倒置显微镜操作步骤 明 场： 1．打开右下方显微镜透射光电源（1）。 明 场： 1．打开右下方显微镜透射光电源（1）。 2．设置聚光器（2），若只需要普通的明场观察，将聚光器设置为“BF”。 若需进行相差观察，按所选择的物镜放大倍数将聚光器设置为“PH1” (10×、20×)或“PH2” (40×)。 3．将所需观察的标本置于载物台上（3）。 4．选择你要用的物镜（4） (4×、10×、20×、40×)。 5．利用调焦操纵轮（5）聚焦和观察图像。 6．若尚需采集图像，见操作步骤13“图像采集操作”。

徕卡DMI3000B倒置显微镜操作步骤 荧 光： 7．在明场观察之后，若还需进行荧光观察，可关闭显微镜透射光电源或上拨上方“Stop”档片（6），挡住透射光，并同时打开荧光独立电源（7） 。 8．打开左侧荧光光栅拉杆（8），使荧光光路打开。 9．转动荧光转盘（9），选择合适的荧光激发滤块(1、2: 空白 3:A蓝色 4:I3绿色 5:N2.1红色)。 10．选择你要用的物镜(4×、10×、20×、40×)。 11．利用调焦操纵轮，聚焦和观察图像。 12．若尚需采集图像，见操作“图像采集操作”。

采集图像：（用徕卡 LAS(Leica Application Suite)采集图象） 13．打开电脑，启动WindowsXP系统，双击LAS图标。 14．在聚焦清晰的状态下打开右侧活动杆（11），使光路通过CCD至电脑。此时可从电脑屏幕上看到图像。 15．点击“获取”→“摄像头”，调整各项参数(如曝光时间等)。 16．点击“获取图像”，命名文件并将文件保存至硬盘。 17．如果要采集同一个视野下的明场和荧光图像，需保证显微镜透射光电源和荧光独立电源均处于开的状态，通过调节Stop”档片，可在聚焦清晰的状态下先关闭左侧荧光光栅拉杆（8），采集明场的图像，保存。然后上拨“Stop”档片，挡住透射光，拉出左侧荧光光栅拉杆（8），使荧光光路开通，采集荧光图像，保存。

注意事项 • 不要频繁开关荧光电源，打开后至少使用半小时才能关闭；关闭后至少半小时才能重新打开(确保汞灯冷却，汞灯寿命约200小时)。 • 保持显微镜各部件(如载物台)的整洁，目镜、物镜、聚光镜等光学部件表面有灰尘时，应先用洗耳球吹掉，再用擦镜纸蘸乙醚:乙醇(7:3)混合液由内向外螺旋形轻轻擦拭干净。 • 用后关闭显微镜电源、电脑，登记使用情况。 • 每次使用后，应待仪器（电源、灯等）冷却，再用防尘罩盖上显微镜和附件。

实验结果观察及分析 荧光蛋白转染效率观察 10X

实验结果观察及分析 明场观察 10X

实验结果观察及分析 荧光下观察 10X

实验结果观察及分析 荧光蛋白显微观察 20X

《细胞培养技术》 规范操作 设备与器材 培养液的除菌与无菌试验9’48” 无菌操作12’34” 细胞的原代培养14’32” 细胞的传代培养26’08” 细胞的冻存30’52” 细胞的复苏41’28”

细胞培养和虚拟实验操作 先看视频，再进行虚拟实验的操作。贴壁和悬浮细胞的传代培养。 http://vl-study.shsmu.edu.cn:8080/virtual/shouye.action 先看视频，再进行虚拟实验的操作。贴壁和悬浮细胞的传代培养。 http://cc.shsmu.edu.cn:8090/G2S/ShowSystem/CourseDetail.aspx?fCourseID=9989&OrgID=442