肽脯氨顺反异构酶和分子伴侣 宓怀风 吸附分离功能高分子材料国家重点实验室 南开大学 化学院高分子化学研究所 生物化学实验室
The prolyl-peptidyl-cis/trans isomerase catalyzes the isomerization of the N-terminal peptidyl bound of proline
Cyclophilin Cyclosporin A PPIase Drug binds to PPIase and suppress its PPIase activity is used as immunosuppresant by organ transplatation Cyclophilin Cyclosporin A 亲环素 环胞菌素A FKBP FK506 (FK506 binding protein)
Schematic comparison of hCyP33 with hCyP18, hCyP40 and RanBP Schematic comparison of FKBP23 with FKBP12 FKBP/PPIase domain FKBP12 106 FKBP/PPIase domain Function unknown domain FKBP23 140 218
第一部分 人T细胞亲环素33 与 mRNA 特异性结合研究 第二部分 哺乳动物内质网体中 FKBP23 与 BiP 特异性结合实验研究
人亲环素33(human cyclophilin 33, hCyP33) Sequence comparisons of the RNA-binding domain of hCyP33
hCyP33 binds specifically to mRNA poly(A)-RNA tRNA RNA洗脱区间 洗脱体积 (ml)
RNA-binding domain cyclophilin AAUAAA ………AAAAAA
Schematic comparison of FKBP23 with FKBP12 106 FKBP12 FKBP/PPIase domain 140 218 FKBP23 FKBP/PPIase domain Function unknown domain 1-19 54 116 154-166 198-210 mFKBP23蛋白质序列结构特征 PPIase Signal peptide EF hand
图3-8 mFKBP23与ncFKBP22氨基酸序列同源性比较 使用DNASTAR中Alignment软件对检出的mFKBP23与ncFKBP22两种蛋白的氨基酸序列进行同源性分析结果。 黑色背景是两个蛋白完全相同的氨基酸。 灰色背景是两个蛋白中性质相似的氨基酸。
ATPase A COOH D E B C Hsp70家族蛋白质结构特征
图3-11 hBip 与 mBip氨基酸序列同源性比较 使用DNASTAR 中 Alignment 软件对检出的hBiP与mBiP两种蛋白的氨基酸序列进行同源性分析结果。黑色背景是两个蛋白完全相同的氨基酸。灰色背景是两个蛋白中性质相似的氨基酸。
图3-9 hFKBP23与mFKBP23氨基酸序列同源性比较 使用DNASTAR中Alignment软件对检出的hFKBP23与mFKBP23两种蛋白的氨基酸序列进行同源性分析结果。 黑色背景是两个蛋白完全相同的氨基酸。 灰色背景是两个蛋白中性质相似的氨基酸。
1 融合蛋白的制备与提纯： 采用pGEX-5X1质粒克隆外源基因，并转化到E.Coli DH5α原菌中进行目的蛋白的表达。
2. 白细胞的分离与内质网体腔液的提取 静置2-4h 血浆 白细胞 红细胞 抗凝处理的新鲜猪全血 从猪全血中分离白细胞
差速离心法提取白细胞内质网体腔液的流程图 用缓冲液重悬提取的白细胞 细胞的裂解 细胞核的分离 1000g,4℃离心10分钟 沉 淀 细胞核 上 清 沉 淀 线粒体的分离 12 000g ,4℃离心30分钟 线粒体 上 清 上 清 内质网体的提取 40000g，4℃ 离心30分钟 细胞浆 沉 淀 上 清 内质网腔液 内质网体膜与腔液的的分离 用PBS/buffer E 重悬沉淀的内质网体两次并经 40000g，4℃ 离心30分钟,最后 100000g，4℃ 离心四小时 沉 淀 内质网膜
ECG beads FKBP23 GST BiP 亲和吸附后以结合缓冲液冲洗未结合的杂蛋白 亲和吸附法研究蛋白质间的相互作用示意图
采用Western blot方法检测蛋白质原理示意图 磷酸化生色体系 脱磷酸显色 偶联的碱性磷酸酶 羊抗家兔IgG的第二抗体 抗目的蛋白的第一抗体 目的蛋白质 硝酸纤维素膜 采用Western blot方法检测蛋白质原理示意图
FKBP23 in ER binds to BiP
Schematic comparison of FKBP23 with FKBP12 106 FKBP12 FKBP/PPIase domain 140 218 FKBP23 FKBP/PPIase domain Function unknown domain 1-19 54 116 154-166 198-210 mFKBP23蛋白质序列结构特征 PPIase Signal peptide EF hand
mFKBP23基因图谱及引物设计
5. mFKBP23n与mFKBP23c分别与 BiP的结合 A 为mFKBP23N端（mFKBP23n） 与ER温育后免疫印迹结果，没有见到明显条带； B，C 分别为mFKBP23全长（mFKBP23）和mFKBP23C端（mFKBP23c）与ER温育后免疫印迹结果，有清晰的 BiP条带。
Publications (1) Mi HF. Kops O. Zimmermann E. Jaschke A. and Tropschug M. A nuclear RNA-binding cyclophilinb in human T cells. FEBS Letters, 398(2-3):201-205, Dec. 1996 IF 3.5 (2) Jaeschke A. Mi HF. and Tropschug M. Cyclophilin 18 binds to antioxidant protein Aop1 and stimulates its activity. Biological Chemistry. Special supplement, 378:7, Sept. 1997 IF 2.4 (3) Jaeschke A. Mi HF. and Tropschug M. Human T cell Cyclophilin 18 binds to Thiol specific antioxidant protein Aop1 and stimulates its activity. Journal of Molecular Biology, 277:763-769, Feb. 1998 IF 6.2 (4) Oliver K. Fischer G. Eckerskorn S. Mi HF. and Tropschug M. Ssp1, a novel parvulin from Neurospora crassa with a polyglutamine module: a site specific proryl isomerase active in protein folding. Journal of Biological Chemistry, 273:31971-31976, Dec. 1998 IF 7.8 (5) Fair K. Anderson M. Bulanova E. Mi H. Tropschug M. and Diaz MO. Protein interactions of the mll phd fingers modulate mll target gene regulation in human cells. Mol. Cell Biol., 21(10):3589-3597, May 2001 IF 9.6 (6) 张万起, 元云峰, 王亦农, 袁 直, 宓怀风*, 何炳林. 人T细胞中核酸结合亲环素(hCyP33)与poly(A)+RNA(mRNA)特异性结合 《中国科学》2002年第二期 (7) Zhang Wanqi, Yuan Yunfeng, Wang Yinong, Yuan Zhi,Mi Huaifeng*, and He Binglin. Human cyclophilin 33 (hCyP33) in T-Cell is bound specifically to poly(A)+RNA (mRNA) Science in China, Series B, April 2002
(8) Vogt P. H. Shan Z. R. Zeisler J. Hirschmann P. Schaller W. Mi H (8) Vogt P.H. Shan Z.R. Zeisler J. Hirschmann P. Schaller W. Mi H. and Habermann B. SPGY in AZFc (Yq11) and SPGYLA on chromosome 3 are structurally homologous but assumed to provide diffrent spermatogenic fuctions in human. Human Reproduction, 12:20, June 1997 IF 3.4 (9) Habermann B. Mi HF. Krause W. and Vogt PH. Localisation of an SPGY gene product in human spermatozoa. Human Reproduction, 11:7, June 1996 IF 3.4 (10) Habermann B. Mi HF. Edelmann A. Bohring C. Backert IT. Kiesewetter F. Aumuller G. and Vogt PH. DAZ (Deleted in AZoospermia) genes encode proteins located in human late spermatids and in sperm tails. Human Reproduction, 13(2):363-369, Feb. 1998 IF 3.4 (11) De-Ming Kong, Long Gu, Han-xi Shen and Huai-feng Mi. A modified molecular beacon combining the propties of TaqMan Chemical Communication, 已接收, 并已上网络版 IF 3.6
致 谢 张万起 元云峰 沈晔 张晓滨 王莞 李慧 王影
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