15 柠檬酸循环

15.1 丙酮酸脱氢酶复合物催化丙酮酸脱羧形成 乙酰CoA 15.2 柠檬酸循环包括八步酶促反应 15.3 柠檬酸循环产生的还原型辅酶通过氧化磷 酸化可以生成ATP 15.4 柠檬酸循环受到严密的调控 15.5 柠檬酸循环中存在着几处代谢物进出口 15.6 植物中乙醛酸循环是柠檬酸循环的支路

柠檬酸循环既是分解代谢途径，又是合成代谢途径，可以说是分解、合成两用途径。 柠檬酸循环又称为三羧酸循环（TCA循环），因为循环中存在三羧酸中间产物。该循环是由H.A.Krebs提出的，又叫做Krebs循环。 柠檬酸循环既是分解代谢途径，又是合成代谢途径，可以说是分解、合成两用途径。 柠檬酸循环中的酶分布在线粒体中。在真核生物中，丙酮酸首先要转运到线粒体内，然后才能进行转换成乙酰CoA的反应。 嵌在内膜中的丙酮酸转运酶可以特异地将丙酮酸从膜间质转运到线粒体的基质中，进入基质的丙酮酸脱羧生成乙酰CoA，经柠檬酸循环进一步被氧化。

15.1 丙酮酸脱氢酶复合物将丙酮酸转化为乙酰CoA 丙酮酸脱氢酶复合物是个多酶集合体，复合物中的酶分子通过非共价键联系在一起，催化一个连续反应，即酶复合物中一个酶反应中形成的产物立刻被复合物中下一个酶作用。

丙酮酸脱氢酶复合物位于线粒体膜上，是由丙酮酸脱氢酶（E1）、二氢硫辛酰胺乙酰转移酶和二氢硫辛酰胺脱氢酶（E3）三种酶，以及TPP（焦磷酸硫胺素）、CoASH、硫辛酸、FAD 、NAD＋和Mg2+ 6种辅助因子组成的。

（1）E1催化丙酮酸脱羧，并将剩下的二碳片段转移到E2的组成成分硫辛酰胺上。 （2）辅酶A与乙酰-二氢硫辛酰胺中的乙酰基反应生成乙酰CoA，并释放出二氢硫辛酰胺。至此丙酮酸转换为乙酰CoA 的反应已经完成，为了能够进行下一轮的丙酮酸转换为乙酰CoA 的反应，必须要将二氢硫辛酰胺转换为硫辛酰胺。 （3）E3催化E2的二氢硫辛酰胺氧化重新形成硫辛酰胺，带有硫辛酰胺的E2再参与下一轮反应。E3的辅基黄素腺苷二核苷酸（E3-FAD）使二氢硫辛酰胺氧化，同时辅基本身被还原生成E3-FADH2，然后E3-FADH2再使NAD＋还原，生成NADH和起始的全酶E3-FAD。 丙酮酸转化为乙酰CoA的反应实际上不是柠檬酸循环中的反应，而是酵解和柠檬酸循环之间的桥梁，真正进入柠檬酸循环的是丙酮酸脱羧生成的乙酰CoA。

15.2 柠檬酸循环包括八步酶促反应 由丙酮酸形成的乙酰CoA或者是其它代谢途径（如脂肪酸或氨基酸的分解代谢途径）产生的乙酰CoA可以通过柠檬酸循环氧化，柠檬酸循环涉及八步酶促反应。

1 缩合 2a 脱水 8 脱氢 7 水化 2b 水化 脱氢 3 氧化脱羧 5 底物水平磷酸化 4 氧化脱羧

进入柠檬酸循环中的2个碳原子的去向 乙酰CoA中乙酰基与草酰乙酸缩合形成 6 碳的柠檬酸，经过 2次氧化脱羧释放出两分子CO2后，形成 4 碳酸－琥珀酸，琥珀酸经过几步反应后又重新转换为草酰乙酸。 由于草酰乙酸可以再生，所以柠檬酸循环可以看作是一个催化多步反应的催化剂，使得乙酰CoA中的二碳单位乙酰基氧化成 2分子CO2。

1、 柠檬酸合成酶催化乙酰CoA与草酰乙酸缩合形成柠檬酸 这是柠檬酸循环的第一个反应，乙酰CoA与草酰乙酸缩合形成柠檬酸和CoASH，反应是由柠檬酸合成酶（也称为柠檬酸缩合酶）催化的。

2、顺乌头酸酶催化前手性分子柠檬酸转化成手性分子异柠檬酸 柠檬酸是个三级醇，不能被氧化为酮酸，顺乌头酸酶把柠檬酸转化为可氧化的二级醇异柠檬酸，酶的名称来自与酶结合的反应中间产物顺乌头酸。 柠檬酸由顺乌头酸酶催化脱水，形成C＝C双键，然后还是在顺乌头酸酶催化下，通过水的立体特异性添加，生成异柠檬酸。

非洲的南部有一种植物（Dicha petalum cymosum）可以产生出氟乙酸，氟乙酸有剧毒，在细胞内它可以转化为氟乙酰CoA，氟乙酰CoA在柠檬酸合成酶的催化下又可与草酰乙酸缩合生成氟柠檬酸。氟柠檬酸类似于柠檬酸，是顺乌头酸酶的一个很强的抑制剂，所以氟乙酸会终止经柠檬酸循环的有氧代谢。

3、异柠檬酸脱氢酶催化异柠檬酸氧化生成-酮戊二酸和CO2 这一步反应是柠檬酸循环中四个氧化还原反应的第一个，是由异柠檬酸脱氢酶催化的。NAD＋作为酶的辅酶。异柠檬酸脱氢使NAD＋还原为NADH＋H＋的同时生成一个不稳定的β-酮酸草酰琥珀酸，草酰琥珀酸经非酶催化的β脱羧作用生成-酮戊二酸和CO2，反应是不可逆的。

4、-酮戊二酸脱氢酶复合物催化-酮戊二酸氧化脱羧生成琥珀酰CoA 反应是由-酮戊二酸脱氢酶复合物催化的，产物琥珀酰CoA同样是一个高能的硫酯。-酮戊二酸脱氢酶复合物包括-酮戊二酸脱氢酶（E1，含有TPP），二氢硫辛酰胺琥珀酰转移酶（E2，含有硫辛酰胺），和二氢硫辛酰胺脱氢酶（E2，含有黄素蛋白）。

5、琥珀酰CoA合成酶催化底物水平磷酸化 琥珀酰CoA合成酶（或称琥珀酸硫激酶）催化琥珀酰CoA转化为琥珀酸，琥珀酰CoA的硫酯键水解会释放出很多的自由能，这些能量可用于驱动GTP或ATP的合成，在哺乳动物中合成的是GTP，而在植物和一些细菌中合成的是ATP。

6、琥珀酸脱氢酶催化琥珀酸脱氢生成延胡索酸 这是柠檬酸循环中的第三步氧化还原反应，带有辅基FAD的琥珀酸脱氢酶催化琥珀酸脱氢生成延胡索酸（反丁烯二酸），同时使FAD还原为FADH2，生成的FADH2再被辅酶Q氧化生成FAD，而辅酶Q还原为还原型辅酶Q（QH2），QH2被释放到线粒体的基质中。

底物类似物丙二酸是琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂。丙二酸结构类似于琥珀酸，也是个二羧酸，可以与琥珀酸脱氢酶的活性部位的碱性氨基酸残基结合，但由于丙二酸不能被氧化，使得循环反应不能继续进行。所以在分离的线粒体和细胞匀浆液中加入丙二酸后，会引起琥珀酸、-酮戊二酸和柠檬酸的堆积，这是研究柠檬酸循环反应顺序的早期证据。

7、延胡索酸酶催化延胡索酸水化生成L-苹果酸 延胡索酸酶（延胡索酸水化酶）通过将 H2O 反式立体特异添加到延胡索酸双键上，催化延胡索酸水化生成L-苹果酸，反应是可逆的。延胡索酸也象柠檬酸一样是一个前手性分子，当延胡羧酸被定位在酶的活性部位时，底物的双键只受到来自一个方向的攻击。

8、苹果酸脱氢酶催化苹果酸氧化重新形成草酰乙酸，完成一轮柠檬酸循环 这是柠檬酸循环的最后一个反应，也是循环中的第4步氧化还原反应。L-苹果酸在以NAD＋为辅酶的苹果酸脱氢酶催化下氧化生成草酰乙酸，同时NAD＋还原生成 NADH反应是可逆的。

15.3 柠檬酸循环产生的还原型辅酶成了通过氧化磷酸化生成ATP 柠檬酸循环的总反应： 乙酰CoA＋3 NAD＋＋FAD＋GDP（或ADP）＋Pi +2H2O→ CoASH＋3 NADH＋3H＋＋FADH2＋GTP（或ATP）＋2 CO2 通过电子传递和氧化磷酸化每一分子的NADH被氧化为NAD＋时可以生成3分子ATP；而一分子FADH2被氧化为FAD时可以产生2分子ATP，因此一分子乙酰CoA通过柠檬酸循环和氧化磷酸化可以产生12分子ATP。 如果将酵解阶段也考虑在内，一分子葡萄糖的降解可以产生多少ATP呢？

（1）丙酮酸脱氢酶复合物的调节 （2）柠檬酸循环中的调节部位 15.4 柠檬酸循环受到严密的调控 丙酮酸脱氢酶复合物存在别构和共价修饰两种调控机制。乙酰CoA和NADH是丙酮酸脱氢酶复合物的抑制剂，NAD＋和CoASH则是丙酮酸脱氢酶复合物的激活剂。另外丙酮酸脱氢酶复合物还受到共价调节，丙酮酸脱氢酶激酶催化复合物中的丙酮酸脱氢酶（E1）磷酸化，导致该酶复合物失去活性，而丙酮酸脱氢酶磷酸酶催化脱磷酸，激活丙酮酸复合物。 （2）柠檬酸循环中的调节部位 由柠檬酸合成酶、异柠檬酸脱氢酶和-酮戊二酸脱氢酶催化的反应可能是调控部位。在体外实验中，ATP抑制该酶。哺乳动物的异柠檬酸脱氢酶受到Ca2＋和ADP的别构激活，而受到NADH 的抑制。在体外实验中，NADH和琥珀酰CoA是-酮戊二酸脱氢酶复合物的抑制剂，但是否在活细胞内具有重要的调节作用还没有确定。

丙酮酸＋CO2＋ATP＋H2O 草酰乙酸＋ADP＋Pi 15. 5 柠檬酸循环中存在着几处代谢物进出口 柠檬酸、-酮戊二酸、琥珀酰CoA和草酰乙酸都直通生物合成途径。例如在脂肪组织，柠檬酸是生成脂肪酸和固醇分子途径中的一环，因为脂肪合成的前体乙酰CoA就是从线粒体被运输到胞液的柠檬酸的裂解产物。 柠檬酸循环的中间代谢物被用于其它生物分子的合成，势必减少它在循环的浓度，影响循环的正常进行，一个重要的调节回补途径是丙酮酸羧化酶催化的由丙酮酸羧化生成草酰乙酸的反应，这个反应是哺乳动物中最主要的回补反应。 丙酮酸羧化酶 丙酮酸＋CO2＋ATP＋H2O 草酰乙酸＋ADP＋Pi

15.6 植物中乙醛酸循环是柠檬酸循环的支路 在后面将讲到，由非糖前体生成糖时需要丙酮酸或者草酰乙酸作为合成的前体。但在动物体内，乙酰CoA不能净合成丙酮酸或者草酰乙酸，所以乙酰CoA不能作为净合成葡萄糖的碳源。 虽然乙酰CoA中的2个碳原子经柠檬酸循环可以整合到草酰乙酸的分子中，但实际上，每整合2个碳原子，而其它2个碳原子又以2个CO2分子通过柠檬酸循环释放出去，所以没有净合成草酰乙酸。 可是在植物、微生物和酵母中却存在着一个可以由2碳化合物生成糖的生物合成途径乙醛酸循环。

在异柠檬酸裂解酶的催化下裂解生成乙醛酸和琥珀酸 其中乙醛酸在苹果酸合成酶催化下与乙酰CoA缩合生成苹果酸，而琥珀酸氧化生成延胡索酸，直至转换成草酰乙酸。

草酰乙酸＋2 CoASH＋2NADH＋QH2＋2H+ 乙醛酸循环的总反应式是： 2乙酰CoA＋2NAD+＋Q  草酰乙酸＋2 CoASH＋2NADH＋QH2＋2H+ 从总反应式可以看出，在乙醛酸循环中乙酰CoA中的碳原子并没有以CO2形式释放，而是净合成了一分子草酰乙酸，草酰乙酸正是合成葡萄糖的前体。 酵母可以在乙醇中生长，因为酵母细胞可以将乙醇氧化成乙酰CoA，乙酰CoA经乙醛酸循环能生成草酰乙酸。同样一些微生物可以在乙酸中生长也是由于这些微生物可以通过乙醛酸循环合成糖的前体。

要点归纳 1. 柠檬酸循环具有双重作用，一方面他是燃料分子氧化的最后共同途径，使燃料分子彻底氧化和生成大量代谢能，另一方面循环的中间产物也是生物合成中构件分子的主要供给源。丙酮酸氧化脱羧形成乙酰CoA将酵解和柠檬酸循环两个途径联系起来。 2. 在细胞质中酵解产生的丙酮酸被转运到线粒体基质，在线粒体中在丙酮酸脱氢酶复合物催化下丙酮酸氧化生成乙酰CoA和CO2。丙酮酸脱氢酶复合物是由丙酮酸脱氢酶、二氢硫辛酰胺乙酰基转移酶和二氢硫辛酰胺脱氢酶组成的，同时还需要硫胺素焦磷酸、硫辛酰胺、CoASH、FAD和NAD＋等辅助因子。

3. 柠檬酸循环发生在线粒体，循环由8步酶促反应组成。柠檬酸合成酶催化乙酰CoA（C2）与草酰乙酸（C4）缩合形成三羧酸柠檬酸（C6）；顺乌头酸酶催化柠檬酸转化为异柠檬酸（C6），然后异柠檬酸在异柠檬酸脱氢酶催化下氧化脱羧形成α-酮戊二酸（C6）和释放出第一个分子CO2，α-酮戊二酸在α-酮戊二酸脱氢酶复合物催化下氧化脱羧形成琥珀酰CoA（C4），同时生成两分子NADH和第二个分子CO2； 在琥珀酰CoA合成酶催化下琥珀酰CoA的硫酯键被切断形成琥珀酸（C4）和CoASH，同时GDP经底物水平磷酸化生成GTP；琥珀酸在琥珀酸脱氢酶催化下氧化形成延胡索酸（C4），同时生成一分子FADH2，然后延胡索酸水化生成苹果酸（C4），最后苹果酸在苹果酸脱氢酶催化下生成草酰乙酸（C4），又生成一分子NADH，完成了一轮柠檬酸循环。

4. 一分子乙酰CoA经柠檬酸循环氧化为两分子CO2的同时，使得3分子NAD＋还原为NADH，一分子FAD还原为FADH2，同时由GDP和Pi生成了一分子的GTP。生成的还原型辅酶三分子NADH＋H＋和一分子FADH2经电子传递和氧化磷酸化可以生成11分子ATP（按照一分子NADH＋H＋生成三分子ATP，一分子FADH2生成二分子ATP计算）。 所以进入柠檬酸循环的一分子乙酰CoA中的二碳单位经柠檬酸循环和氧化磷酸化，实际上相当于生成12分子ATP。所以一分子的葡萄糖经酵解、丙酮酸脱氢酶复合物、柠檬酸循环以及电子传递和氧化磷酸化可以产生36分子或38分子ATP。

5. 柠檬酸循环只有在有氧条件下才能进行，因为循环需要不断供给NAD＋和FAD。当NADH和FADH2将他们的电子经电子传递链传给O2时，重新生成电子受体NAD＋和FAD，同时生成大量ATP。由丙酮酸形成乙酰CoA是丙酮酸进入柠檬酸循环的重要调控点，丙酮酸脱氢酶复合物受到产物乙酰CoA和NADH 的抑制和CoASH和NAD＋的激活，同时该酶还受到可逆的磷酸化共价修饰调节。柠檬酸循环中异柠檬酸脱氢酶和α-酮戊二酸脱氢酶复合物也是两个重要的调控部位。 6. 柠檬酸循环也是例如核苷酸碱基、蛋白质和血红素等重要生物分子的构件分子的供给源，由于循环中的中间产物用于生物合成，就会消弱循环。为了使循环能够持续代谢燃料，由丙酮酸羧化形成草酰乙酸那样的回补反应就可以补充循环的中间产物。

7. 在植物和细菌中存在着乙醛酸循环，该循环是个与柠檬酸循环密切相关的途径。乙醛酸循环途径使得植物和某些微生物可以直接将乙酰CoA用于合成糖。