Proteomics of filamentous fungi 丝状真菌蛋白质组学

主要内容 引言 细胞壁溶解和样品制备 胞内蛋白质组学 亚蛋白质组学 分泌组

引言 虽然丝状真菌是具有重要商业价值的生物体的重要组成，但是人们对它的关注还是比较少尤其是和酵母菌相比。 然而，丝状真菌具有重要的应用价值例如，在生物技术产业，丝状真菌是用来产生各种各样的产品，范围从人类治疗药物（如抗细菌和抗真菌剂）到特殊化学品（如商业酵素，有机酸），这些加在一起，每年的销售额有数十亿美元。其中的成分之一，降低胆固醇的他汀类，在美国每年有近150亿美元的市场。 同时丝状真菌也是与人类和植物密切相关的病原体。

随着越来越多的真菌基因组测序，真菌研究的重要性日益突出。到目前为止，已有18个不同的物种被测序和注册。 棒曲霉、黄曲霉、烟曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、土曲霉、灰葡萄孢霉、球毛壳菌、灰盖鬼伞、禾谷镰孢菌、轮状镰刀菌、稻瘟病菌、粗糙脉孢菌、黄孢原毛平革菌、米根霉、核盘菌〔菌核病菌〕、颖枯壳针孢。 尽管丝状真菌的研究越来越多但是与酿酒酵母或病原体白色念球珠菌相比还是研究较少，特别是在转录组学和蛋白质组学这两方面的分析尤为明显。

Lim等人报道了对里氏木霉细胞包膜蛋白和Bruneau等人报到了对烟曲霉糖基化锚定蛋白的研究。 到目前为止，丝状真菌的后基因组研究才刚刚开始，利用开发丝状真菌表达重组蛋白的潜能，需要加大在转录和蛋白质组学这两方面的研究。 Lim等人报道了对里氏木霉细胞包膜蛋白和Bruneau等人报到了对烟曲霉糖基化锚定蛋白的研究。

细胞壁溶解和样品制备 因为丝状真菌具有非常坚硬的细胞壁，所以如何有效的破壁充分释放细胞内蛋白质就成为真菌蛋白质组学中样品制备的关键之一。 细胞裂解之后，使用三氯醋酸(TCA)对蛋白溶液纯化以除去可能对等电聚焦电泳产生干扰的杂质。 虽然可以有效的纯化样品，但是三氯醋酸的处理使蛋白的溶解性难以满足接下来的等电聚焦电泳的要求。 为了克服这一困难，Nandakumar等人制定了一个节省时间的程序包括氢氧化钠的简单处理以促进三氯醋酸沉淀蛋白质的溶解。最近，Kniemeyer等人，利用两性离子进一步优化沉淀蛋白的溶解性。 其他的报道称在沉淀之前使用磷酸盐缓冲液增溶，以及使用酸性提取液减少真菌样品细胞壁造成的拖尾。

胞内蛋白质组学 Herna´ndez-Macedo等利用2-DE 构建差异性比较研究木质素降解真菌和香菇，细胞质蛋白的表达模式是否与铁的存在与否有关，从这些木质素降解真菌中发现21种蛋白与铁的摄取有关。 Grinyer等人首次应用质谱对真菌蛋白质组学进行进一步的进展（MALDI - TOF及LC-MS/MS研究），以确定哈茨木霉全细胞蛋白质提取物。研究人员从单一凝胶分离的数百个蛋白中，确定25个作为初步蛋白质组图谱。 虽然这种鉴定方法已普遍的使用于其他生物的蛋白质组学研究，然而Grinyer等人首先将其用来研究丝状真菌。

Petter Melin和他的同事第一个报道了构巢曲菌(A. nidulans)蛋白质。 在他们的最新研究中，他们将真菌和乳酸产生菌共同培养，研究由共同培养引起的与形态变化相关的蛋白的表达水平的变化。 Kniemeyer等人提供了第一幅烟曲霉菌(A.fumigatus)蛋白图谱。他们通过比较生长在两种不同碳源上的微生物蛋白质的表达模式建立碳分解代谢物阻遏(CCR)的系统特征。从生长在乙醇上的微生物发现52种蛋白，其中发现许多糖异生，乙醛酸循环，乙醇降解上调表达的关键酶。

蛋白质组学分析可用来系统的了解致病真菌的致病因素。 例如Ferna´ndez-Acero等人提供了第一张灰葡萄孢霉(Botrytis cinerea)蛋白质组2-DE图谱，鉴定发现许多蛋白是苹果酸脱氢酶和甘油三磷酸脱氢酶的异构体并与植物病原性灰霉病相关联。作者在接下来的研究中第一次确定灰霉病致病因素和治疗靶点。同样，绘制另一植物病原性真菌，核盘菌(S. sclerotiorum)的蛋白质组图谱被，可对研究a-L-阿拉伯呋喃糖酶（a-L-Arabinofuranosidase ） 是否参与真菌致病性提供线索。

蛋白质组学分析同样可以为研究系统代谢变化提供有效的帮助。 Shimizu等人利用二维凝胶从黄孢原毛平革菌(P.chrysosporium)分离出1100个细胞内蛋白和300个线粒体蛋白，观察发现当黄孢原毛平革菌生长于含有香兰素的培养基时会有47个细胞内蛋白和10个线粒体蛋白出现表达差异。他们的研究不仅鉴定了参与香兰素代谢的关键酶，也掲示了黄孢原毛平革菌(P.chrysosporium)由乙醛酸循环至三羧酸循环的新陈代谢转变。 这些研究表明蛋白质组学，具有描述参与适应环境变化的各种生化途径特征的能力。

Asif等人报道了第一张烟曲霉（A.fumigatus）表面蛋白的亚蛋白质组图谱，其目的是寻找针对这种人类病原体的潜在治疗靶点。 亚蛋白质组学 Herna´ ndez-Macedo等人报道了从黄孢原毛平革菌(P.chrysosporium)和香菇(L .edodes)提取质膜蛋白和外膜蛋白的程序。 虽然这是通过一维SDS-PAGE电泳而不是二维电泳。 Asif等人报道了第一张烟曲霉（A.fumigatus）表面蛋白的亚蛋白质组图谱，其目的是寻找针对这种人类病原体的潜在治疗靶点。 细胞壁和细胞膜亚蛋白质组学的研究有助于我们系统的了解参与发病机制蛋白的蛋白分泌和细胞间相互作用。

亚蛋白质组学的优势是，能够研究在某一特定细胞器中定位表达的蛋白，从而为我们具有研究特定生理状态下细胞中蛋白质功能的能力。 线粒体同样受到关注。 Grinyer等人第一次报道了线粒体亚蛋白质组，介绍了一种简单有效的制备样品的程序以及哈茨木霉(T.harzianum)线粒体亚蛋白质组图谱。他们鉴定了25个独特的线粒体蛋白，它们包括三羧酸循环，分子伴侣，结合蛋白和转运蛋白如线粒体膜内在蛋白。 Schmitt等人报道了对粗糙脉孢菌(N. crassa)线粒体外膜蛋白质组学分析。研究人员从一维SDS-PAGE中得到的蛋白利用LC-MS/MS 和 MALDI-TOF研究，从而规避了2DE无法对难溶和疏水的线粒体蛋白进行分析的缺陷。 亚蛋白质组学的优势是，能够研究在某一特定细胞器中定位表达的蛋白，从而为我们具有研究特定生理状态下细胞中蛋白质功能的能力。

分泌组 分泌组就是结合有天然分泌蛋白和参与这些蛋白分泌的细胞机制。 许多真菌需要分泌大量的蛋白质以适应它们的腐生营养生活方式 ，这表明必须分泌大量胞外水解酶去降解过量的潜在基质。许多这样的蛋白质在病原体研究或生物技术产业生产重组蛋白的过程中具有特殊的价值。

Oda等人研究米曲霉(A. oryzae)的分泌组并鉴定29个胞外蛋白 。 Wilson Francisco和他的同事是这一领域的开拓者，他们建立了真菌分泌组样品制备的程序。根据这些程序，他们研究了黄曲霉（A. flavus）并鉴定了22个参与芦丁降解的分泌蛋白。这有助于建立对细胞酶降解次生代谢产物的初步了解。他们在接下来的工作中利用LC-MS/MS研究鉴定额外的51个分泌蛋白，发现其中18个出现在芦丁降解途径。 Oda等人研究米曲霉(A. oryzae)的分泌组并鉴定29个胞外蛋白 。

Sua´rez等人报道研究以甲壳素（一种重要的细胞壁成分）或以其他真菌的细胞壁 为营养源的哈茨木霉(T Sua´rez等人报道研究以甲壳素（一种重要的细胞壁成分）或以其他真菌的细胞壁 为营养源的哈茨木霉(T.harzianum)的分泌组学。他们发现对于不同的基质，真菌的胞外蛋白2-DE图谱有着显著的差异。然而，尽管有些分歧，但是在所有的条件下最丰富的蛋白是一种新型的天冬氨酸蛋白酶，它与乳白耙菌（Irpex lacteus）的polyporopepsin有着较高的同源性。 由此推测，这种蛋白质在营寄生的木霉菌（Trichoderma spp）中发挥着基础性的作用。

结束语 作者认为当前真菌蛋白质组学的研究进入了一个快速发展阶段。从相关的研究结果迅速涌现和频频举行的各种学术会议可以得到证实。