Alternative splicing of mRNA molecule 核酸实验研究技术进展－3 mRNA分子选择性剪接 Alternative splicing of mRNA molecule I want to see how alternative splicing affects proteins on a high level. What big variations are there in the proteins of a gene because of alternative splicing?

过去人们一直认为，基因的遗传密码子连续不断地并列在一起，形成一条没有间隔的完整的基因体。 核酸实验研究技术进展－3 关于mRNA分子的剪接 过去人们一直认为，基因的遗传密码子连续不断地并列在一起，形成一条没有间隔的完整的基因体。 结构分析发现，在真核蛋白质编码基因的核苷酸序列中间插入有与氨基酸编码无关的DNA间隔区，使一个基因的编码区被分隔成若干个不连续的区段。 编码序列不连续的基因被称为断裂基因。断裂基因编码区中的不编码区段被称为内含子，而各个编码区段则被称为外显子。 通常，有内含子的基因首先转录成mRNA 前体，之后内含子被剪除，与此同时各个外显子依次被拼接在一起。成熟的mRNA只含有如下三部分：1）外显子序列，2）5’转录非翻译区，3）3’转录非翻译区。 mRNA前体分子中内含子的删除过程就是mRNA分子的剪接。

transcription and past-transcribed modification for albumin gene 核酸实验研究技术进展－3 transcription and past-transcribed modification for albumin gene L 1 2 3 4 5 6 7 5’ A B C D E F G gene-7.7kb 47 185 51 129 118 143 156 1043 transcription hnRNA 5’ modification modified mRNA 5’ m7G5’ppp5’ m2’G AAA AAA to form lariat 5’ m7G5’ppp5’ m2’G AAA AAA lariat mRNA splicing 5’ m7G5’ppp5’ m2’G AAA AAA mature mRNA

外显子与内含子之间剪切位点的特异性 核酸实验研究技术进展－3 上图左示意电子显微镜下的一个套索结构。 上图 右示意电子显微镜下的一个哺乳动物剪接体，它包括U1，U2，U4，U5和U6snRNA还有额外的蛋白质。这个剪接体以约25nm×50nm的颗粒状态存在，可能由一些被刚性结构连接着的分立的区域构成。 以上介绍的是RNA的剪切修饰。

内含子两端剪切点左右毗邻序列的一致性并不高。 GT(GU)-AG法则对许多真核生物核基因是适用的，然而有例外情况。 核酸实验研究技术进展－3 内含子两端剪切点序列具有高度一致性，即GT……AG或GU……AG；因此也曾有人把内含子定义成一段从双核苷酸GT(GU)开始到双核苷酸AG结束的特殊的核苷酸序列，通常把这一规律称为GT-AG法则或GU-AG法则。 内含子两端剪切点左右毗邻序列的一致性并不高。 GT(GU)-AG法则对许多真核生物核基因是适用的，然而有例外情况。 GT(GU)-AG法则并不适用于线粒体DNA编码基因内含子，同时也不适用于酵母tRNA基因内含子。 出于对内含子剪接过程的关注，我们 考虑剪接点的特性，即发生了断裂和愈合的两个分界线 。 通过对mRNA序列与结构基因核苷酸序列的比较，我们可以确定外显子与内含子的接合点。发现，在一个内含子的两端并不存在广泛的相似性或互补性。然而，接点还是具有很好的保守性，尽管只是短短的一致序列。 数字指示了特定的碱基在每个一致性位点存在的百分比。结果只在内含子接点上有高一致性序列发现。这样，基因内含子序列就可以定义为：GT……AG 因为把内含子定义成从双核苷酸GT开始到双核苷酸AG结束，所以接点经常被描述为遵守GT-AG法则，RNA中实际的序列为GU-AG法则（因为，在RNA中，实际的序列为GU-AG）。 GT-AG法则可以描述许多真核生物核基因中的剪接点。并不适用于线粒体中的内含子，也不适用于酵母的tRNA基因

Process of mRNA Splicing 核酸实验研究技术进展－3 Process of mRNA Splicing Genome: 5’ 3’ Intergenic Gene Intergenic pre-mRNA 5’ 3’ Exon1 Intron1 Exon2 Intron2 Exon3 GU AG GU AG Donor Site Acceptor Site U2 U1 过去人们一直认为，基因的遗传密码子是连续不断地并列在一起，形成一条没有间隔的完整的基因体。但以后通过对真核蛋白质编码基因结构的分析发现，在它们的核苷酸序列中间插入有与氨基酸编码无关的DNA间隔区，使一个基因分隔成不连续的若干区段。我们称这种编码序列不连续的间断基因为断裂基因。 在很多情况下，有内含子的基因首先转录成RNA 前体，之后内含子被去除，外显子被拼接到一起。成熟的mRNA只含有外显子序列。 我们把内含子的删除过程称为RNA的剪接 In higher eukaryotes (mouse, human) only (lower eukaryotes have a simpler process) Think of in three separate steps Step1: Gene is copied out of chromosomal DNA. Step2: Splicing Step3: mRNA ready to be translated At the splicing step, two things happen. U1, part of the spliceosome complex, finds the donor site. Very strong signal here, because if it’s off by a base, there’s a frame shift (drastic consequences). Then U2, another part of spliceosome, finds the acceptor site. Come together, along with other factors, and cut out everything in between Donor and Acceptor. Cover Exons and Introns In reality, these happen at the same time, and quite quickly. Also ignoring other modification to necessary to produce mRNA (capping etc. that tell the mRNA where to go). Splicing to mature mRNA Transcriptome: 5’ 3’ Exon Exon Exon

25nm×50nm颗粒状态，可能由一些被刚性结构连接着的分立的区域构成，包括U1、U2、U4、U5、U6snRNA和一些蛋白质。 核酸实验研究技术进展－3 mRNA剪接套索结构电子显微镜照片 哺乳动物mRNA剪接体电子显微镜照片 25nm×50nm颗粒状态，可能由一些被刚性结构连接着的分立的区域构成，包括U1、U2、U4、U5、U6snRNA和一些蛋白质。

U1-snRNA U2-snRNA exon-1 exon-2 pG-O-H intron-1 mRNA剪接体以及套索形成示意图 核酸实验研究技术进展－3 mRNA剪接体以及套索形成示意图 AG……. UCCAUACAUAPPPGm AUGAUGU PPPGm exon-1 exon-2 intron-1 U1-snRNA U2-snRNA pG-O-H ….....AGGUAUGU UACUACA Second transesterification First transesterification

核酸实验研究技术进展－3 mRNA剪接三阶段 第一阶段：在内含子5’端剪切位点剪切，形成一个切口，使内含子与左侧外显子断离。左侧外显子以直线形式存在。内含子形成套索，在空间上拉近了左右两个外显子之间的距离（这里内含子的5’端和内含子内一个碱基连接形成5’-2’键，这个目标碱基为腺苷A，被称为分枝点）。 第二阶段：在内含子3’端剪切位点剪切，使内含子与右侧外显子断离，同时，左右两侧外显子连接起来。 第三阶段：内含子脱离套索复合体，呈线性化状态。线性化内含子很快被降解。 剪接机理己在利用能把内含子从RNA前体上剪接掉的体外实验中得到描述。 1.核的外提物能剪接纯化的RNA前体，这表明剪接与转录无关。剪接也独立RNA的修饰，即使RNA即无帽子结构也无多聚腺苷尾部，它还是可以发生 。 2. 分三个步骤： 第一阶段，在内含子5′端剪接点形成一个切口，左边的外显子以直线形式存在，右边的内含子一外显子则开成索套（这里内含子5′端和内含子内一个碱基形成5′-2′键，这个目标碱基为腺苷，被称为分枝点）。 第二阶段，3′端剪接点的剪切从索套形式中释放了内含子，同时，右边的外显子和左边的外显子连接起来。 第三阶段，索套随即脱离分枝点，形成一个线性的删除内含子，然后很快被降解。

mRNA选择性剪接是指一个mRNA前体通过不同的剪接方式，即选择不同的剪接位点组合，产生不同的mRNA剪接异构体的过程。 核酸实验研究技术进展－3 mRNA选择性剪接基本概念 mRNA选择性剪接是指一个mRNA前体通过不同的剪接方式，即选择不同的剪接位点组合，产生不同的mRNA剪接异构体的过程。 mRNA的选择性剪接是mRNA分子的原初转录本选择性地剪除内含子，连接外显子，变为各种不同形式的成熟mRNA分子的过程。 选择性剪切不仅仅是mRNA剪去内含子的过程，还包括不同外显子之间的组合过程。

研究显示，约35%－60%的人类基因在mRNA剪接时有选择性。 核酸实验研究技术进展－3 两条重要信息： 首次发现RNA选择性剪接现象：1980年， Baltimore在研究小鼠IgM 基因表达时，发现不同的外显子组合可以分别产生膜型和分泌型IgM。 研究显示，约35%－60%的人类基因在mRNA剪接时有选择性。

核酸实验研究技术进展－3 主要相关技术： RT-PCR 琼脂糖电泳 基因组DNA测序 cDNA测序 RNA酶保护分析 生物信息学比对

核酸实验研究技术进展－3 Hela、BEL7402和EC9706细胞系中发现可能存在NRDR (NADP-dependent retinol dehydrogenase/reductase)基因mRNA新的剪接亚型

Analysis of mRNA alternative splicing sites 核酸实验研究技术进展－3 pre-mRNA GT AG 3’ 5’ Analysis of mRNA alternative splicing sites Intron-1 Intron-2 Intron-1’’’’ Intron-1’ Intron-1’’’ Intron-1’’’’’ Intron-1’’ GT AG

内含子5’端剪切位点右移（right shift），导致外显子增长。 内含子5’端剪切位点左移（left shift），导致外显子缩短。 核酸实验研究技术进展－3 mRNA选择性剪接的类型 内含子5’端剪切位点右移（right shift），导致外显子增长。 内含子5’端剪切位点左移（left shift），导致外显子缩短。 内含子3’端剪切位点右移（right shift），导致外显子缩短。 内含子3’端剪切位点左移（left shift），导致外显子增长。 内含子保留。 外显子切除。 ……………。 …………。 单独一个基因通过选择性剪接产生的十几种剪接异构体的现象很常见。有些基因甚至能够产生成千上万种剪接异构体。最突出的例子是果蝇（Drosophila melanogaster ） 的Dscam 基因，可以通过选择性剪接产生38,000多种mRNA异构体。 如果将选择性剪接与其它RNA加工过程（如RNA编辑）联系起来共同考虑，基因产物会更复杂。例如，果蝇的para基因有13个可变外显子，可编码1536种不同的mRNA，另外，para的转录体还要经过在11个已知位点的RNA编辑，这样理论上一共可以产生1，032，192个不同的para 转录异构体。 因此，根据受选择性剪接影响的基因的概率，以及单个基因可能产生的选择性剪接体的数目，足以表明选择性剪接对蛋白质组多样性的巨大影响。

Type of mRNA alternative splicing 核酸实验研究技术进展－3 pre-mRNA Exon1 Intron1 Exon3 Exon2 Intron2 GT AG 3’ 5’ Exon1’ Intron1’ Intron1’’’’ Exon2’’ Type of mRNA alternative splicing Exon1’’ Intron1’’’ Intron1’’ Exon2’

mRNA选择性剪接是基因表达调控重要机制之一。 核酸实验研究技术进展－3 mRNA选择性剪接的主要生物学意义： mRNA选择性剪接是基因表达调控重要机制之一。 mRNA选择性剪接是产生蛋白质组多样性的重要机制。 mRNA选择性剪接使成熟mRNA更具多样性，因此扩大了蛋白质生物合成模板的数量，同时也使得同源蛋白质的表现型更丰富，增加了彼此间互为制约因素这一新的重要环节。 mRNA选择性剪接是物种进化的重要方式之一。 1.选择性剪接是在RNA水平调控基因表达的机制之一。 一个基因通过选择性剪接产生多个转录异构体，各个不同的转录异构体编码结构和功能不同的蛋白质，它们分别在细胞/个体分化发育不同阶段，在不同的组织，有各自特异的表达和功能。因此，选择性剪接是一种在转录后RNA水平调控基因表达的重要机制。 2.多样性与复杂性 选择性剪接是从相对简单的基因组提高蛋白质组多样性的重要机制，而蛋白质组的多样性又与多细胞高等生物的复杂性相适应。从选择性剪接涉及的基因分布格局分析，选择性剪接多发生在参与信号传导和表达调节等复杂过程的基因上，如受体，信号传导通路（凋亡），转录因子等。对个体分化发育和一些关键的细胞生理过程如凋亡、细胞兴奋等的精确调控有重要意义。

mRNA选择性剪接是调节基因表达和产生蛋白质组多样性的重要机制 核酸实验研究技术进展－3 mRNA选择性剪接是调节基因表达和产生蛋白质组多样性的重要机制 选择性剪接是调节基因表达和产生蛋白质组多样性的重要机制。 选择性剪接可以从一个基因产生多种蛋白，从而使蛋白质组中蛋白质的数量超过基因组中基因的数量。其中，从影响基因的数量和生物种类范围来看，选择性剪接是扩大蛋白质多样性的最重要的机制

小鼠、猕猴、滇金丝猴和长臂猿的大脑中仅表达 Neuropsin Type I。 核酸实验研究技术进展－3 小鼠、猕猴、滇金丝猴和长臂猿的大脑中仅表达 Neuropsin Type I。 在人胚胎脑中，Neuropsin Type I和Neuropsin Type II两种类型都有表达，由不同剪接方式导致。 在人胚胎脑中，Neuropsin Type I和Neuropsin Type II两种类型丰度相似。 在成人脑中， Neuropsin Type II成为优势表达的蛋白酶， Neuropsin Type I仅有少量表达。 Neuropsin Type II可能只在人大脑中表达。 实例1： Neuropsin基因mRNA的选择性剪接 Neuropsin是一种主要在大脑海马区表达的丝氨酸蛋白酶。 Neuropsin的功能主要同大脑的发育以及学习和记忆相关。 研究发现： 同时，智力的进化始终是一个让人琢磨不透的课题, 。最新研究发现， 1.以智力的研究为例， Neuropsin是一种主要在大脑海马区表达的丝氨酸蛋白酶。该基因同学习和记忆的功能调节以及大脑的发育相关。 2.研究发现，小鼠仅表达 TypeI蛋白酶,检测的猕猴、滇金丝猴和长臂猿的大脑中也只表达Type-I。在人的胚胎中，TypeI和TypeII两 种剪切方式都有表达，且丰度相似。在成人脑中，TypeII蛋白酶成为优势表达的蛋白酶，TypeI仅有少量表达。研究发现TypeII 只在人的大脑中表达。 从以上知识背景来看，RNA选择性剪切极具重要性。

实例2：辅酶II依赖性视黄醇脱氢酶基因mRNA的选择性剪接 核酸实验研究技术进展－3 实例2：辅酶II依赖性视黄醇脱氢酶基因mRNA的选择性剪接 辅酶II依赖性视黄醇脱氢酶（NADP-dependent retinol dehydrogenase/reductase，NRDR ）普遍存在于哺乳动物肝脏。 人NRDR基因位于14q11.2，曾被命名为DHRS4，由3个外显子簇（clusters），共97634碱基组成。Cluster 1、Cluster 2和Cluster 3分别含有8、8和7个外显子。 Cluster 1是人与哺乳动物共有的保守序列。NRDR基因mRNA由Cluster 1转录。 研究发现， NRDR基因在人宫颈癌、肝癌、食管癌和黑色素瘤等许多肿瘤细胞中存在mRNA选择性剪接亚型。

人DHRS4 （NRDR）基因mRNA选择性剪接亚型构造特点 核酸实验研究技术进展－3 人DHRS4 （NRDR）基因mRNA选择性剪接亚型构造特点