淋巴细胞的分离 和功能检测 Separation and Assays for Lymphocytes

第一节 外周血单个核细胞的分离 外周血单个核细胞 （peripheral blood mononucler cell，PBMC):单核细胞 淋巴细胞

人不同细胞的漂浮密度 红细胞：1.09~1.1 嗜酸性：1.09~1.095 嗜中性：1.080~1.085 B细胞：1.062~1.075 T细胞：1.065~1.077 NK： 1.050~1.070 单核细胞：1.050~1.066 血小板：1.030~1.060

Ficoll分层液分离法 属于单次密度梯度离心分离法 分离液组成： 聚蔗糖（商品名为Ficoll） 泛影葡胺（常用商品为isopaque、hypaque） 故又称Ficoll-hypaque分层液

Ficoll： 分子量：40KD 高密度 低渗透压 无毒性 使用浓度：60g/L (密度：1.020） 泛影葡胺： 使用浓度：340g/L（密度：1.200）

Ficoll-hypaque的密度： 分离人外周淋巴细胞：1.077±0.001 分离小鼠淋巴细胞 ：1.088 分离马淋巴细胞 ：1.090

操作过程： 将抗凝全血以Hank’s液适当稀释后轻轻叠加在分层液上.试验尽量在低温下进行（4 ℃ ~8 ℃或冰浴）。 水平式离心（2000rpm，20min） 吸出白色云雾状单个核细胞层，洗涤3次备用

密度梯度分离单个核细胞（Ficoll分层液）

细胞活性： ＞95% 单个核细胞纯度：＞95% 细胞获得率： ＞80% 最佳温度： 20℃

Percoll分离法 属于连续密度梯度离心分离法 Percoll：包有乙烯吡咯顽酮的硅胶粒 特点：渗透压低、黏度小、无毒 扩散常数低，可形成稳定的梯度

操作： Percoll原液（密度1.135）加等量磷酸缓冲液 高速离心，使分层液形成连续密度梯度 将细胞悬液叠加在分层液上，低速离心后得到四个细胞层 吸取所需细胞层，洗涤备用

密度梯度分离单个核细胞（ Percoll分层液）

细胞活性：＞95% 细胞纯度： ＞98% 细胞获得率： ＞75% 最佳温度： 20℃

密度梯度离心法注意事项： 无菌操作 安全防护 注意最佳温度操作 适当稀释血液样品（稀释倍数至少1倍，但要收集血浆成分则不能稀释）

第二节：外周血淋巴细胞的分离和纯化 外周血单个核细胞中还含有少量单核细胞，甚至还有少量红细胞和血小板，若特定试验要求应该除去这些成分.

红细胞去除法 低渗裂解法 PBMC中加入无菌双蒸水，调节浓度至2X106，轻轻混匀45s，即刻加入等体积1.8%氯化钠，使溶液恢复等渗。

氯化铵处理法 PBMC中加入一定量的0.83%的氯化铵溶液，轻轻震荡2分钟，即可溶解红细胞

血小板去除法 离心洗涤法 HBSS或PBS洗涤分离的PBMC 2-3次，可去除大部分血小板。

单核细胞去除法 粘附法 单核细胞37℃下能粘附在塑料或玻璃表面，淋巴细胞则不能，将PBMC置于细胞培养瓶中培养1小时，即可去除单核细胞。 淋巴细胞纯度：＞95% 活性：＞95%

L-亮氨酸甲酯在溶酶体酶的作用下可转化成有毒L-亮氨酸- L-亮氨酸甲酯，导致单核细胞破坏。同时可去除NK细胞和Tc细胞。 淋巴细胞纯度：＞99% 活性：＞95%

羰基铁吞噬法 单核细胞可吞噬羰基铁粉，吞噬后的细胞比重增大，分层液密度梯度离心时沉淀于管底。

免疫磁珠法 利用抗体致敏的磁珠与细胞结合，让细胞通过磁细胞分选仪，分离具有特异标记的免疫细胞。

外周血淋巴细胞及其亚群的选择性分 离及纯化 第三节 外周血淋巴细胞及其亚群的选择性分 离及纯化 T细胞及其亚群的选择性分离 尼龙棉柱分离法 利用B细胞和单核细胞易于粘附于尼龙纤维表面的特性，可将T和B细胞分离

操作： 将尼龙毛（聚酰胺纤维）填充于5-6mm内径的塑料管中，单个核细胞悬液加入，37℃1-2小时，10%-20%FCS灌洗，收集洗脱液。

回收率：20%~30% T细胞纯度：＞90% 一般不用于分离B细胞

花环形成法-E花环 成熟T细胞表面有绵羊红细胞受体，即E受体（CD2),可与绵羊红细胞结合形成花环，经Ficoll密度梯度离心，再经裂解即可获得T细胞。

T细胞回收率差异大 T细胞纯度：＞95% 分离过程可能激活某些T细胞

免疫磁珠分离法 将抗体与磁性微珠结合形成免疫磁珠（immmunomagnetic beads，IMB),免疫磁珠与细胞结合后，在外加磁场的作用下，免疫磁珠-细胞复合物被吸附，从而起到分离的作用。 单克隆抗体-磁珠分离系统 （monoclonal antibody-magnetic cell sorting，MACS)

阳性分离： 获得被吸附的细胞 阴性分离： 获取非吸附细胞

分离纯度：80%~99% 得率：60%~90%，仅次于流式细胞仪

CD4+ T细胞

流式细胞仪分选法 流式细胞术（flow cytometry，FCM)是一种可以对细胞或亚细胞结构进行快速测量的分析和分选技术

流式细胞仪 流动室和液流系统 激光源和光学系统 光电管和检测系统 计算机和分析系统

细胞纯度：＞99% 细胞得率：＞90% 细胞活性：＞95%

B细胞及其亚群的选择性分离 尼龙棉柱法 操作见T细胞分离部分 该法曾经是经典的B细胞分离方法，但收获率较低，现已很少使用

EA花环 B细胞表面带有IgG Fc段受体，AgAb复合物中IgG Fc段牢固结合；这类红细胞抗体致敏的动物红细胞（EA)黏附在B细胞周围形成花环。

免疫磁珠法 流式细胞分选法

细胞的保存及活力测定 保存 10%~20%的灭活小牛血清等渗培养液重悬。 短期置4℃，长期：二甲亚砜+ -196℃ 活力测定 台盼兰染色死细胞呈蓝色，活细胞不着色。

Assays for Lymphocyte Surface Markers 第四节 淋巴细胞表面标记的检测 Assays for Lymphocyte Surface Markers

淋巴细胞的表面标志 CD抗原 特 异 性 CD2 E受体、全部T细胞和部分NK细胞 CD3 成熟T细胞 CD4 Th细胞、Mφ、HIV受体 CD8 Tc细胞、NK细胞的亚型 CD25 IL-2受体、活化T细胞 CD16、CD56 NK细胞

免疫荧光技术 直接法 间接法

微量细胞毒实验 针对表面标记的单抗与免疫细胞结合后，在补体的作用下会杀伤该细胞，细胞膜失去屏障作用，加入伊红染料后会将细胞染成红色，阴性细胞不着色。

免疫酶染技术 抗体用特异性的酶标记后不影响其与抗原结合，将酶标记抗体与免疫细胞作用，在酶底物存在时，阳性细胞将产生颜色反应，在光学显微镜下即可对免疫细胞进行定量和定性

ABC法（Avidin-biotin-HRP complex ）

APAAP(Alkaline phosphatase-anti-alkaline phosphatase technique) 碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶桥联酶染色法(APAAP法)，用兔抗鼠IgG起搭桥作用，其中一个Fab段连接McAb ，另一个Fab段连接APAAP复合物，再通过复合物中的碱性磷酸酶催化底物显色来判断抗原分子的存在。

APAAP酶免疫桥联法

第五节 T、B淋巴细胞功能检测

一、T细胞功能检测 （一）T细胞增殖试验 T细胞在体外受有丝分裂原或抗原刺激后，细胞代谢和形态发生变化，主要表现为胞内蛋白质和核酸合成增加，发生一系列增殖反应。如细胞变大、胞质增多、出现空泡、核质疏松、核仁明显并转化为淋巴母细胞，又称淋巴细胞转化试验（lymphocyte transformation test ,LTT)

丝裂原诱导的增殖反应 技术方法 1. 用RPMI－10将PBMC配成1x106/ml的悬液。 T细胞增殖功能测定 丝裂原诱导的增殖反应 技术方法 1. 用RPMI－10将PBMC配成1x106/ml的悬液。 2. 用100g/ml的PHA配制1:10、1:20和1:40稀释液。 3. 96孔板中选择一行（共12孔），每孔中加入100µl细胞。指定每相邻3孔为一组。前3组分别加入一种稀释度的PHA溶液，最后一组加培养液（对照组）。 4. 37°C ，5％CO2，54h。 5. 配制浓度为50µci/ml的3HTdR。

丝裂原诱导的增殖反应 6. 每孔加入50µci 3HTdR，继续培养18h。 7. 用多孔自动收集仪分别收集每孔细胞于一小管中。溶解细胞，将DNA过滤到滤纸上，洗去未掺入的3HTdR，最后用100％的甲醇洗涤，以利滤纸干燥。 8. 将滤纸放入液闪管内，自动计数，打印结果。 9. 扣除本底，计算每一组3个复本的平均数。

丝裂原诱导的增殖反应 影响因素 1. 细胞活力：冷冻技术影响细胞活力，复苏后应检查细胞活力。 T细胞增殖功能测定 丝裂原诱导的增殖反应 影响因素 1. 细胞活力：冷冻技术影响细胞活力，复苏后应检查细胞活力。 2. 培养液中添加的血清：有些血清可能激活或抑制细胞增殖。如欲测定人体细胞增殖能力，可采用灭活的AB血清。 3. 细胞培养板类型：根据细胞数量采用不同形状底部的培养板。 4. 微生物污染：可降低细胞增殖能力。

T细胞增殖功能测定 单向混合淋巴细胞培养反应 原理 T细胞受体能够识别同种异型MHC分子。当把2个不同个体的单个核细胞在体外混合时，可以相互刺激，引起增殖。增殖的强度与两者之间MHC的差别的程度成正比。所以同种异型混合淋巴细胞反应的强度反映2个个体之间MHC差别的程度，并且因为相互识别与增殖，结果是2个个体的淋巴细胞增殖能力的总和。这种试验就是双向混合淋巴细胞培养试验。 将参加反应之一方的单个核细胞用放射性核素照射，使其失去反应能力，但仍保存刺激能力，成为刺激细胞，则此时的反应结果仅反映另一方（反应方）的增殖能力。在实质性器官移植时，只需了解受者淋巴细胞对供者MHC的反应能力，所以适合采用单向混合淋巴细胞培养反应。

单向混合淋巴细胞培养试验 方法 1. 分离宿主与供者的PBMC，调整细胞浓度为1 x 106/ml。 T细胞增殖功能测定 单向混合淋巴细胞培养试验 方法 1. 分离宿主与供者的PBMC，调整细胞浓度为1 x 106/ml。 2. 刺激细胞灭活：用丝裂霉素（终浓度25µg，37 °C， 5％C，30min）或放射性核素照射（2000 rad）的方法处理刺激细胞。 3. 96孔板中，每孔加入1x105的刺激细胞和1x105反应细胞。 37°C，5％CO2，4～6d。加3HTdR，继续培养18h。阳性对照孔加反应细胞和丝裂原，不加刺激细胞。阴性对照孔只加照射的自身细胞。3复本。 4. 收集细胞，液闪仪计数，打印结果。

单向混合淋巴细胞培养 5. 计算相对反应（RR） （实验组cpm－阴性对照组cpm） RR＝ 阳性对照组cpm－阴性对照组cpm T细胞增殖功能测定 单向混合淋巴细胞培养 5. 计算相对反应（RR） （实验组cpm－阴性对照组cpm） RR＝ 阳性对照组cpm－阴性对照组cpm

单向混合淋巴细胞培养 注意点 1. 细胞活力：使用冷冻细胞时，复苏后应检查细胞活力。 T细胞增殖功能测定 单向混合淋巴细胞培养 注意点 1. 细胞活力：使用冷冻细胞时，复苏后应检查细胞活力。 2. 培养液中添加的血清：有的血清可能会刺激或抑制反应。 3. 本底应小于2000 rpm，阳性对照组应大于20000 rpm。

成熟淋巴细胞 转化淋巴细胞

T细胞增殖功能测定 抗原诱导的特异性增殖反应 原理 本试验测定T细胞在体外对某一特定抗原的特异性免疫应答能力。所用抗原可以是初次接触的抗原，也可以是曾经免疫过的抗原。常用的测定回忆反应的抗原有纯化蛋白衍生物（PPD）和破伤风类毒素（TT）。这2种抗原都被常规列入计划免疫接种范畴，成人应该对它们有回忆反应。在某些免疫缺陷病中，对它们的特异性回忆反应可减弱或消失。

抗原性刺激物： 破伤风类毒素 链球菌激酶 纯化蛋白衍生物 白色链球菌 同种异型抗原（HLA)

抗原诱导的特异性增殖反应 方法（以T细胞对破伤风类毒素刺激的增殖反应为例） 1. 分离PBMC和APC，APC用丝裂霉素或放射性核素处理。 2. 96孔板中每孔加入1x105 PBMC和1x104 APC。 3. 每孔中加入系列稀释的破伤风类毒素溶液，不同孔中抗原终浓度分别为0、1、5、10和20µg/ml。每一种浓度设3复本。 4. 37C°，5％CO2，6天。 5. 加3HTdR，继续培养18小时。计数。

T细胞增殖功能测定 抗原诱导的特异性增殖反应 结果解释 1. 对于接种过破伤风疫苗者来说，本试验结果呈低反应反映患者对破伤风类毒素特异性应答能力低下或全身免疫缺陷。 2. HIV感染者反应低下反映CD4+T细胞减少导致的免疫缺陷。

抗原诱导的特异性增殖反应 注意点 1. 培养液中最好用人AB血清。 T细胞增殖功能测定 抗原诱导的特异性增殖反应 注意点 1. 培养液中最好用人AB血清。 2. 此T细胞增殖反应需要APC。如使用纯化T细胞，需加5％～10％自身APC。

抗原诱导的特异性增殖反应 应用实践 1. 丝裂原诱导的增殖反应 T细胞增殖功能测定 抗原诱导的特异性增殖反应 应用实践 1. 丝裂原诱导的增殖反应 临床上用于评估T细胞对多克隆刺激剂的增殖能力，反映T细胞基本免疫功能，即T细胞群总体的信息，不能反映个别T细胞克隆的情况 PHA常用于测试人T细胞增殖能力，Con A常用于测试小鼠T细胞增殖能力。

抗原诱导的特异性增殖反应 应用实践 2. 单向混合淋巴细胞反应 1）本方法主要用于估计器官移植前供体与受者之间MHC相配程度。 T细胞增殖功能测定 抗原诱导的特异性增殖反应 应用实践 2. 单向混合淋巴细胞反应 1）本方法主要用于估计器官移植前供体与受者之间MHC相配程度。 2）如培养时间超过96 小时，可制备细胞毒性T细胞（CTL）。

抗原诱导的特异性增殖反应 应用实践 3. 抗原诱导的特异性增殖反应 用于估计机体对特异性抗原的应答能力和机体总体免疫应答能力。 T细胞增殖功能测定 抗原诱导的特异性增殖反应 应用实践 3. 抗原诱导的特异性增殖反应 用于估计机体对特异性抗原的应答能力和机体总体免疫应答能力。

MTT法 四甲基偶氮唑盐（MTT)在活细胞线粒体的琥珀酸脱氢酶作用下，被还原成黑色的MTT-甲臢，形成的MTT-甲臢的量与细胞增值程度正相关。

(二)T细胞介导的细胞毒性（lymphocyte mediated cytotoxicity，LMC) 形态学检测法 抑制率（%）=（对照组平均残留肿瘤细胞数-实 验对照组残留细胞数）/对照组平均残留肿瘤细胞数x100%

CTL杀伤功能的测定 基础理论 CTL为细胞毒性T淋巴细胞的简称。是CD8＋T细胞识别APC表面MHC I类分子递呈的肿瘤或病毒特异性抗原肽后，分化形成的。当CTL遇到相应的肿瘤细胞或病毒感染细胞时，能够通过细胞接触机制或裂解机制杀伤靶细胞。

CTL杀伤功能的测定 1. 细胞接触机制 CTL表达FasL，靶细胞表达Fas，FasL与Fas的配接，通过Fas传入的信号激活靶细胞内细胞凋亡途径，导致靶细胞死亡。 2. 细胞裂解机制 CTL激活后，胞质内颗粒向2个细胞接触点移动。颗粒膜与细胞膜融合通过外吐释放颗粒内容物。穿孔素插入靶细胞膜后聚合，在靶细胞膜上形成孔，造成细胞裂解。颗粒酶诱导靶细胞凋亡。

CTL杀伤功能的测定 51Cr标记法原理 如在将靶细胞与CTL混合之前，先用放射性核素51Cr培育， 51Cr能穿过细胞膜进入胞浆，与胞浆中小分子蛋白质牢固结合，不能自由从细胞内释放。当靶细胞膜被CTL破坏后， 51Cr被释放进入上清。因为上清中放射性强度与细胞杀伤程度呈正比，通过测定上清中放射性强度，就可以判定CTL杀伤能力。

51Cr释放法 51Cr特异性释放率（%）=（实验组上清cpm均值-对照组上清cpm）/(最大释放组cpm均值-对照组上清cpm均值）

(三)T细胞分泌细胞因子检测 ELISA法

生物活性测定法 增敏实验 一些肿瘤细胞细胞株依赖细胞因子方能在体外增殖，可利用这些依赖细胞株检测相应的细胞因子

依赖性肿瘤细胞株 所依赖的细胞因子 TF-1 GM-CSF、IL-3 DTLL IL-2 TTD-1 IL-6 FDC-PL 小鼠IL-3

功能检测实验 利用一些细胞因子的功能特异性建立相应的活性测定方法 IFN的抗病毒实验 TNF对L929细胞的杀伤作用

细胞因子mRNA的测定 分子杂交实验 反转录PCR技术

二、 B细胞功能检测技术 (一)B细胞产生抗体能力的测定 基础理论 B细胞受到多克隆激活剂或特异性抗原刺激后，活化、增殖，最后分化成为浆细胞，产生抗体。抗体可以在血浆和其他体液中检出，检测抗体是测定B细胞功能的最重要的方法。 B细胞分类：B1细胞和B2细胞。两者发生学不同、接受刺激的抗原不同，对T细胞的依赖性不同。 由于B2细胞对抗原的应答依赖T细胞，所以，B细胞产生抗体能力的低下，其缺陷也可能起源于T细胞缺陷。

丝裂原诱导多克隆抗体产生能力的测定 基础理论 B细胞产生抗体能力的测定 丝裂原诱导多克隆抗体产生能力的测定 基础理论 人B细胞具有PWM受体，在体外受到PWM刺激时，发生多克隆激活，产生多克隆抗体。B细胞产生抗体的能力可以用ELISA测定培养上清中抗体的量估计，也可以用ELISPOT方法测定产生抗体的B细胞数量估计。

丝裂原诱导多克隆抗体产生能力的测定 技术方法与评价 B细胞产生抗体能力的测定 丝裂原诱导多克隆抗体产生能力的测定 技术方法与评价 1. 分离PBMC96孔板中每孔加入1x105细胞和PWM终浓度（1：100）。阴性对照孔内不加PWM。每一实验设2 复本。 2. 37C°5％CO2培养10天（ELISA）或7天（ELISPOT）。 3. 收集上清，用ELISA法测抗体。收集细胞，用ELISPOT法测产生抗体的B细胞。

丝裂原诱导多克隆抗体产生能力的测定 应用实践 1. 用于确定B细胞活化和分化的信号转导机制，以及细胞因子和其它银子对B细胞分化的影响。 2. 因为B2细胞产生抗原需要T细胞辅助，所以又可以用于检测T细胞的辅助功能。 3. 临床上用于研究免疫缺陷病和自身免疫病患者B细胞分化异常的机制。

丝裂原诱导多克隆抗体产生能力的测定 注意点 B细胞产生抗体能力的测定 丝裂原诱导多克隆抗体产生能力的测定 注意点 采用以抗体为基础的技术（如磁珠法、淘洗法和流式细胞仪）分离的B细胞，需考虑抗体对B细胞产生抗体的影响（促进或抑制作用）。

B细胞产生抗体能力的测定 ELISPOT法 基础理论 ELISPOT全称为酶联免疫斑点试验（enzyme－linked immunospot assay），可用于测定产生IgG和IgM抗体的B细胞。其方法是用抗原包被固相，然后加入抗原特异性B细胞。如果B细胞产生抗体，抗体与板上的抗原结合。加入酶标二抗和显色剂就会显色。一个斑点就代表一个产生抗体的细胞。

ELISPOT法 技术方法 1. 抗原包被：37C°2h，或4C°过夜。固相载体可用聚苯乙烯平皿、亚硝酸纤维膜、96孔板。 B细胞产生抗体能力的测定 ELISPOT法 技术方法 1. 抗原包被：37C°2h，或4C°过夜。固相载体可用聚苯乙烯平皿、亚硝酸纤维膜、96孔板。 2. 抗体生成细胞培育：加入适量抗体生成细胞，37C°，5％CO2，3～4h，或过夜。洗涤，去除为与固相结合的细胞。 3. 测定斑点产生细胞：加二抗， 37C°，5％CO2，2～3h。加辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶和底物显色。 4 计数：24h后用10～30倍显微镜下计数斑点形成细胞。

ELISPOT法 评价 1. 在操作中应使用无关抗原作阴性对照；并应排除细胞标本终抗体污染。 2. 硝酸纤维素膜灵敏度高于聚苯乙烯。 B细胞产生抗体能力的测定 ELISPOT法 评价 1. 在操作中应使用无关抗原作阴性对照；并应排除细胞标本终抗体污染。 2. 硝酸纤维素膜灵敏度高于聚苯乙烯。 3. 与ELISA联合使用，可以估计单个细胞的抗体产量。 4 当淋巴细胞受到严重污染时，也可以使用本法，所以适用于测定组织中抗体生成细胞。 应用实践 用途同ELISA法。本方法可用于任何可溶性抗原。

ELISPOT比ELISA灵敏度高102～103倍 ELISPOT不仅能分析细胞因子分泌的总量变化，更能独特检测活化淋巴细胞的数量变化。 ELISPOT可精确到检测出一百万个淋巴细胞中的一个活化细胞的细胞因子分泌

B细胞产生抗体能力的测定 ELISA测定各类免疫球蛋白 基础理论 B细胞受抗原刺激后，最初产生IgM抗体，然后在Th细胞产生的各种细胞因子的作用下，可转类成为IgG、IgA、IgE类抗体。应用不同的单抗，结合ELISA方法，可以测定B细胞产生的抗体的类别。

B细胞产生抗体能力的测定 ELISA测定各类免疫球蛋白 方法 1. 包板：96孔板用浓度为10µg/ml的特异性单抗包被。盖上盖板，37C°，5％CO2，2h，或4C°过夜。常规洗板，封闭。 2. 上样：每孔内加入1:10或1:20 稀释的细胞培养上清液100µl。阳性对照为标准品，阴性对照为培养液。每试验设2复本。室温培育2h，或4C°过夜。 3. 加酶标二抗：每孔加100µl碱性磷酸酶标记的羊抗人IgM或IgG或IgA二抗。室温培育2h，或4C°过夜。 4. 显色：洗板，每孔加100µl底物（p－nitrophenyl phosphate）。 5. 自动酶标仪读数，从标准曲线读出抗体浓度。

ELISA测定各类免疫球蛋白 评价 应用实践 B细胞产生抗体能力的测定 ELISA测定各类免疫球蛋白 评价 ELISA法灵敏、简单、快速、特异性高、重复性好，是测定上清和体液中Ig的首选方法。碱性磷酸酶标记的二抗显色明显，不必用碱中止反应，尤其适用于测定体外产生的抗体。 应用实践 ELISA可测定各种体液中的抗体，其结果反映被检个体B细胞功能。测定免疫球蛋白各种亚类的水平有助于鉴定免疫缺陷病。

(二)抗体形成细胞测定 反向溶血空斑形成实验（reversed hemolytic plaque assay，RHPA ） 待检人的PBMC或组织来源的淋巴细胞（如扁桃体、脾细胞等）

待检人的PBMC或组织来源的淋巴细胞（如扁桃体、脾细胞等） SPA致敏的羊红细胞（SPA-SRBC） 抗人Ig抗体 补体