分子生物学实验

实验目录 碱裂解法小量制备质粒DNA 2.感受态细胞制备 3.质粒转化 4.聚合酶链式反应（PCR）

实验一 碱变性法小量制备质粒DNA

一、实验目的 掌握碱裂解法提取质粒的方法

二、实验原理

分离质粒DNA方法 碱变性法 煮沸法 SDS法 羟基磷灰石层析法等

碱变性法基本原理 在pH 12.0-12.6碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体DNA变性，而共价闭环质粒DNA仍为自然状态 将PH调至中性并有高盐浓度存在的条件下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构，大部分DNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍为可溶状态，通过离心可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，再用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA

三、实验材料

实验试剂 ＬＢ培养基： 胰化蛋白胨 10g 酵母提取物 5g 定容 1000ml pH7.5 NaCl 10g ＳＴＥ： 0.1M NaCl 10mM Tris HCl(pH8.0) 1mM EDTA ＡｍＰ 50mg/ml 溶菌酶 10mg/ml (用10mM Tris·HCl pH8.0新鲜配制）

溶液Ⅰ： 50mM 葡萄糖 25mM Tris·HCl（pH8.0） 10mM EDTA 溶液Ⅱ：（新鲜配制） 0.2N NaOH 1% SDS 溶液Ⅲ： 5M KAC 10ml 冰醋酸 11.5ml 水 28.5ml 酚，氯仿，乙醇 RNase 琼脂糖 ＴＥ： 10mM Tris-HCl(pH8.0) 1mM EDTA

四、实验方法 １．挑取琼脂培养板上的单菌落至5ml LB培养液中（含AmP 50μg/ml）， ３７℃强烈摇荡过度 ２．取1.5ml培养液至Eppendorf管中，12000g离心30秒，弃上清，用１ml STE悬浮菌体，再离心回收菌体，并重复一次，弃上清，取沉淀 ３．将细菌沉淀悬浮于100μl预冷溶液Ⅰ中，振荡混匀，冰上放置5分钟

四、实验方法 ４．加入200μl溶液Ⅱ，盖严管盖轻柔颠倒以混匀内容物，冰上放置5分钟 ５．加入150μl溶液Ⅲ，温和振荡数次，冰上放置５分钟 ６．12000g 4 ℃离心５分钟，取上清移到１个新的Eppendorf管中 ７．加入等体积酚/氯仿（１：１），振荡混匀，12000g 4 ℃离心２分钟。取上清移至另１个Eppendorf管中

８．加入２倍体积无水乙醇，振荡混匀，于室温静置2分钟。 ９．12000g ,4 ℃离心５分钟。 10．弃上清，加入１ml 70%乙醇漂洗沉淀，盖严管盖颠倒数次，12000g 4 ℃离心２分钟。 11．弃上清，抽干乙醇，室温干燥（5-15分钟）。 12．加入50μl TE（含20μg/ml RNA 酶，不含DNA酶）溶解DNA。

13．取10μl DNA溶解液用ＴＥ稀释至1000ul测定OD260和OD280,计算OD260/OD2 80之比 14.同时以以下公式计算得率 质粒DNA得率： 稀释倍数×OD260×0.05×50/1.5ml 15．取10μl DNA溶解液加2μl Loading buffer于1%琼脂糖,电泳3小时,电压40伏。 16．电泳凝胶在透射式紫外检测仪上观察，记录结果

五、实验结果分析 １．根据质粒DNA OD260,OD280值，计算质粒DNA得率和DNA纯度 ２．记录电泳结果并说明结果内容

六、思考题 １．简要叙述溶液Ⅰ、溶液Ⅱ和溶液Ⅲ的作用，以及实验中 分别加入上述溶液后，反应体系出现的现象及其成因 ２．简要叙述酚氯仿抽提ＤＮＡ体系后出现的现象及其成因

实验二 大肠杆菌感受态细胞制备

实验目的 学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞的方法

实验原理 感受态：细菌能够吸收外源DNA的生理状态称为感受态 本实验以 E.coli DH5α 菌株为受体细胞，用 CaCl2 处理受体菌使其处于为感受态

实验仪器

超净工作台

台式高速冷冻离心机

恒温空气摇床

实验试剂   大肠杆菌DH5α   LB培养基，   0.1mol/LCaCl2溶液（预冷）

实验步骤 菌株活化 感受态细胞制备

实验步骤 菌株活化 1．用接种环直接取冻存的大肠杆菌DH5α，在LB培养基平板表面划线，于37℃培养16小时 2．挑取一个单菌落，转到3－5mlLB培养基中，于37℃培养3－5小时 3．将培养液全部转到100mlLB培养基中培养2－3小时，到OD600＝0.3－0.4

感受态细胞制备 4．将培养液转入1.5ml离心管中，在冰上放置15－30min 5．6000rpm离心10min,弃上清 6．加入0.3ml预冷的0.1mol/l CaCl2,悬浮沉淀，冰上预冷10min 7．4000rpm离心5 min,弃上清 8．加入0.2ml预冷含有甘油的0.1mol/l CaCl2,悬浮沉淀，即为感受态细胞，可－70℃长期保存

思考题 1.常用制备感受态细胞的大肠杆菌有哪些 2. 第8步中氯化钙溶液中甘油的作用是什么

实验三 氯化钙诱导质粒转化

实验目的 1.了解转化的概念及其在分子生物学研究中的意义 2.学习将外源质粒 DNA 转入受体菌细胞并筛选转化体的方法

转化 将外源 DNA 分子引入受体细胞，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究的基本实验技术

常用转化方法 电击法 CaCl2、RuCl等化学试剂法

实验原理 本实验以 E.coli DH5α 菌株为受体细胞，用 CaCl2 处理受体菌使其处于为感受态，加入 pUC18质粒，在钙离子的作用下，质粒与钙离子形成复合物吸附在细菌细胞表面，经42℃短暂热刺激，细胞膜通透性增大，可吸收吸附的质粒DNA，即实现转化

实验原理 pUC18质粒携带有抗氨苄青霉素的基因，接受该质粒的受体菌具有抗氨苄青霉的特性。将转化后的受体细胞于含氨苄青霉素平板培养基上培养，只有转化体才能存活，而未受转化的受体细胞则因无抵抗氨苄青霉素的能力而死亡

抗Amp 宿主细菌 含Amp培养基

影响转化率的因素 细胞生长状态和密度 转化的质粒DNA质量、浓度 试剂的质量 防止杂菌和其它外源DNA污染

实验仪器

超净工作台

台式高速冷冻离心机

恒温空气摇床

恒温培养箱 培养皿

实验试剂   感受态细胞大肠杆菌DH5α   LB培养基，   0.1mol/LCaCl2溶液（预冷）   氨苄青霉素 pUC18质粒

实验步骤 1. 取目的DNA加入大肠杆菌感受态细胞中，于冰上放置30min 2. 于42℃水浴90S 3. 冰上放置2min 4. 加入1ml LB液体培养基于37℃培养1小时

实验步骤 5. 3000rpm离心2min 6. 吸出上清液0.8ml，将剩余液体轻轻吸打、混合均匀 7. 将培养液均匀涂布在含Amp+的培养基平板上 8. 将平板放置于37℃恒温培养箱中培养12-14个小时，然后观察结果

对照组 对照组1: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,其它操作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现 对照组2: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,但涂板时只取5μl 菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此组正常情况下应产生大量菌落

转化率 转化频率（转化子数／每mg质粒DNA）＝转化子总数／质粒DNA加入量(mg) 　　转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率，公式如下： 　　转化子总数＝菌落数×稀释倍数×转化反应原液总体积／涂板菌液体积 转化频率（转化子数／每mg质粒DNA）＝转化子总数／质粒DNA加入量(mg)

感受态细胞转化效率＝转化子总数／感受态细胞总数 　　感受态细胞总数＝对照组２菌落数×稀释倍数×菌液总体积／涂板菌液体积 感受态细胞转化效率＝转化子总数／感受态细胞总数

实验结果

思考题 分子生物学中常用的载体有哪些 实验步骤第4步加入1ml LB液体培养基于37℃培养1小时的作用是什么

实验四 聚合酶链式反应（PCR）

实验目的 通过本实验学习PCR反应基本原理与实验技术

实验原理 聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，故又称为基因的体外扩增法。 在待扩增的DNA片断两侧和与其两侧互补的两个寡核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增2n倍。

PCR技术原理 1.变性：在加热或碱性条件下可使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA，称之为变性

聚合酶链式反应示意图 靶DNA的扩增 目的片段（不同长度的链未示出） (c) (b) 引物2 5’ 3’ (a) 引物1 引物2互补链 新引物 靶DNA的扩增 (a) 引物1 引物2互补链 引物1互补链 单位长度的链 不同长度的链 目的片段（不同长度的链未示出） 聚合酶链式反应示意图 (e) (f) (g)

温度（℃） 时间（min） 94 72 60 94℃变性（1min） 60 ℃退火（1min） 72 ℃延伸（1.5min） 循环1 循环2 循环3 PCR反应的温度循环周期 PCR 反应的每一个温度循环周期都是由DNA变性、引物退火和反应延伸三个步骤完成的。图中设定的反应参数是94℃变性1min， 60 ℃退火1min， 72 ℃延伸1.5min。如此周而复始，重复进行，直至扩增产物的数量满足实验需求为止

PCR反应中的主要成份 1. 引物 2. 4种三磷酸脱氧核苷酸(dNTP) 3. Mg2+ 4. 模板 5. Taq DNA聚合酶 6. 反应缓冲液

实验仪器 电泳仪

琼脂糖凝胶电泳槽

PCR仪

凝胶成像系统

移液器

实验材料 1、DNA模板 2、4种dNTP 3、引物1、引物2 4、Taq酶 5、琼脂糖 6、DNA相对分子质量标准物 7、吸头、50ul PCR管

试剂 10×PCR缓冲液(含Mg2＋) 4×dNTP (每种1mmol) Tag酶 1U/ul DNA模板 引物1: 5`- GGGGAATTCATGGTGAGCAAGGGC-3` 引物2: 5`-GACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGC-3` 引物溶液浓度 10pmol/ul

实验步骤 在0.5ml RCR管内配置20ul反应体系： CK(ul) 1#(ul) 模板 1 引物1 0.4 引物2   CK(ul) 1#(ul) 模板 1 引物1 0.4 引物2 10× PCR Buffer 2 Taq酶 0.5 dNTPs ddH2O 14.3 15.3 Total 20

PCR反应程序 (1) 94℃变性5min， (2) 94℃变性1min， (3) 52 ℃退火1min， (4) 72 ℃延伸1min。 (5) 重复(2)-(4)30次 （6）72 ℃延伸1min。

PCR结果。1、对照(无模板)；2－6、PCR产物（5ul样品） 实验结果 PCR结果。1、对照(无模板)；2－6、PCR产物（5ul样品）

思考题 进行一次成功的PCR反应顺注意哪些问题