分子生物学实验.

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分子生物学实验

实验目录 碱裂解法小量制备质粒DNA 2.感受态细胞制备 3.质粒转化 4.聚合酶链式反应(PCR)

实验一 碱变性法小量制备质粒DNA

一、实验目的 掌握碱裂解法提取质粒的方法

二、实验原理

分离质粒DNA方法 碱变性法 煮沸法 SDS法 羟基磷灰石层析法等

碱变性法基本原理 在pH 12.0-12.6碱性环境中,线性的大分子量细菌染色体DNA变性,而共价闭环质粒DNA仍为自然状态 将PH调至中性并有高盐浓度存在的条件下,染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构,大部分DNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀,而质粒DNA仍为可溶状态,通过离心可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质,质粒DNA尚在上清中,再用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA

三、实验材料

实验试剂 LB培养基: 胰化蛋白胨 10g 酵母提取物 5g 定容 1000ml pH7.5 NaCl 10g STE: 0.1M NaCl 10mM Tris HCl(pH8.0) 1mM EDTA AmP 50mg/ml 溶菌酶 10mg/ml (用10mM Tris·HCl pH8.0新鲜配制)

溶液Ⅰ: 50mM 葡萄糖 25mM Tris·HCl(pH8.0) 10mM EDTA 溶液Ⅱ:(新鲜配制) 0.2N NaOH 1% SDS 溶液Ⅲ: 5M KAC 10ml 冰醋酸 11.5ml 水 28.5ml 酚,氯仿,乙醇 RNase 琼脂糖 TE: 10mM Tris-HCl(pH8.0) 1mM EDTA

四、实验方法 1.挑取琼脂培养板上的单菌落至5ml LB培养液中(含AmP 50μg/ml), 37℃强烈摇荡过度 2.取1.5ml培养液至Eppendorf管中,12000g离心30秒,弃上清,用1ml STE悬浮菌体,再离心回收菌体,并重复一次,弃上清,取沉淀 3.将细菌沉淀悬浮于100μl预冷溶液Ⅰ中,振荡混匀,冰上放置5分钟

四、实验方法 4.加入200μl溶液Ⅱ,盖严管盖轻柔颠倒以混匀内容物,冰上放置5分钟 5.加入150μl溶液Ⅲ,温和振荡数次,冰上放置5分钟 6.12000g 4 ℃离心5分钟,取上清移到1个新的Eppendorf管中 7.加入等体积酚/氯仿(1:1),振荡混匀,12000g 4 ℃离心2分钟。取上清移至另1个Eppendorf管中

8.加入2倍体积无水乙醇,振荡混匀,于室温静置2分钟。 9.12000g ,4 ℃离心5分钟。 10.弃上清,加入1ml 70%乙醇漂洗沉淀,盖严管盖颠倒数次,12000g 4 ℃离心2分钟。 11.弃上清,抽干乙醇,室温干燥(5-15分钟)。 12.加入50μl TE(含20μg/ml RNA 酶,不含DNA酶)溶解DNA。

13.取10μl DNA溶解液用TE稀释至1000ul测定OD260和OD280,计算OD260/OD2 80之比 14.同时以以下公式计算得率 质粒DNA得率: 稀释倍数×OD260×0.05×50/1.5ml 15.取10μl DNA溶解液加2μl Loading buffer于1%琼脂糖,电泳3小时,电压40伏。 16.电泳凝胶在透射式紫外检测仪上观察,记录结果

五、实验结果分析 1.根据质粒DNA OD260,OD280值,计算质粒DNA得率和DNA纯度 2.记录电泳结果并说明结果内容

六、思考题 1.简要叙述溶液Ⅰ、溶液Ⅱ和溶液Ⅲ的作用,以及实验中 分别加入上述溶液后,反应体系出现的现象及其成因 2.简要叙述酚氯仿抽提DNA体系后出现的现象及其成因

实验二 大肠杆菌感受态细胞制备

实验目的 学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞的方法

实验原理 感受态:细菌能够吸收外源DNA的生理状态称为感受态 本实验以 E.coli DH5α 菌株为受体细胞,用 CaCl2 处理受体菌使其处于为感受态

实验仪器

超净工作台

台式高速冷冻离心机

恒温空气摇床

实验试剂   大肠杆菌DH5α   LB培养基,   0.1mol/LCaCl2溶液(预冷)

实验步骤 菌株活化 感受态细胞制备

实验步骤 菌株活化 1.用接种环直接取冻存的大肠杆菌DH5α,在LB培养基平板表面划线,于37℃培养16小时 2.挑取一个单菌落,转到3-5mlLB培养基中,于37℃培养3-5小时 3.将培养液全部转到100mlLB培养基中培养2-3小时,到OD600=0.3-0.4

感受态细胞制备 4.将培养液转入1.5ml离心管中,在冰上放置15-30min 5.6000rpm离心10min,弃上清 6.加入0.3ml预冷的0.1mol/l CaCl2,悬浮沉淀,冰上预冷10min 7.4000rpm离心5 min,弃上清 8.加入0.2ml预冷含有甘油的0.1mol/l CaCl2,悬浮沉淀,即为感受态细胞,可-70℃长期保存

思考题 1.常用制备感受态细胞的大肠杆菌有哪些 2. 第8步中氯化钙溶液中甘油的作用是什么

实验三 氯化钙诱导质粒转化

实验目的 1.了解转化的概念及其在分子生物学研究中的意义 2.学习将外源质粒 DNA 转入受体菌细胞并筛选转化体的方法

转化 将外源 DNA 分子引入受体细胞,使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究的基本实验技术

常用转化方法 电击法 CaCl2、RuCl等化学试剂法

实验原理 本实验以 E.coli DH5α 菌株为受体细胞,用 CaCl2 处理受体菌使其处于为感受态,加入 pUC18质粒,在钙离子的作用下,质粒与钙离子形成复合物吸附在细菌细胞表面,经42℃短暂热刺激,细胞膜通透性增大,可吸收吸附的质粒DNA,即实现转化

实验原理 pUC18质粒携带有抗氨苄青霉素的基因,接受该质粒的受体菌具有抗氨苄青霉的特性。将转化后的受体细胞于含氨苄青霉素平板培养基上培养,只有转化体才能存活,而未受转化的受体细胞则因无抵抗氨苄青霉素的能力而死亡

抗Amp 宿主细菌 含Amp培养基

影响转化率的因素 细胞生长状态和密度 转化的质粒DNA质量、浓度 试剂的质量 防止杂菌和其它外源DNA污染

实验仪器

超净工作台

台式高速冷冻离心机

恒温空气摇床

恒温培养箱 培养皿

实验试剂   感受态细胞大肠杆菌DH5α   LB培养基,   0.1mol/LCaCl2溶液(预冷)   氨苄青霉素 pUC18质粒

实验步骤 1. 取目的DNA加入大肠杆菌感受态细胞中,于冰上放置30min 2. 于42℃水浴90S 3. 冰上放置2min 4. 加入1ml LB液体培养基于37℃培养1小时

实验步骤 5. 3000rpm离心2min 6. 吸出上清液0.8ml,将剩余液体轻轻吸打、混合均匀 7. 将培养液均匀涂布在含Amp+的培养基平板上 8. 将平板放置于37℃恒温培养箱中培养12-14个小时,然后观察结果

对照组 对照组1: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,其它操作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现 对照组2: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,但涂板时只取5μl 菌液涂布于不含抗生素的LB平板上,此组正常情况下应产生大量菌落

转化率 转化频率(转化子数/每mg质粒DNA)=转化子总数/质粒DNA加入量(mg)   转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子,根据皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率,公式如下:   转化子总数=菌落数×稀释倍数×转化反应原液总体积/涂板菌液体积 转化频率(转化子数/每mg质粒DNA)=转化子总数/质粒DNA加入量(mg)

感受态细胞转化效率=转化子总数/感受态细胞总数   感受态细胞总数=对照组2菌落数×稀释倍数×菌液总体积/涂板菌液体积 感受态细胞转化效率=转化子总数/感受态细胞总数

实验结果

思考题 分子生物学中常用的载体有哪些 实验步骤第4步加入1ml LB液体培养基于37℃培养1小时的作用是什么

实验四 聚合酶链式反应(PCR)

实验目的 通过本实验学习PCR反应基本原理与实验技术

实验原理 聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR),是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法,故又称为基因的体外扩增法。 在待扩增的DNA片断两侧和与其两侧互补的两个寡核苷酸引物,经变性、退火和延伸若干个循环后,DNA扩增2n倍。

PCR技术原理 1.变性:在加热或碱性条件下可使DNA双螺旋的氢键断裂,形成单链DNA,称之为变性

聚合酶链式反应示意图 靶DNA的扩增 目的片段(不同长度的链未示出) (c) (b) 引物2 5’ 3’ (a) 引物1 引物2互补链 新引物 靶DNA的扩增 (a) 引物1 引物2互补链 引物1互补链 单位长度的链 不同长度的链 目的片段(不同长度的链未示出) 聚合酶链式反应示意图 (e) (f) (g)

温度(℃) 时间(min) 94 72 60 94℃变性(1min) 60 ℃退火(1min) 72 ℃延伸(1.5min) 循环1 循环2 循环3 PCR反应的温度循环周期 PCR 反应的每一个温度循环周期都是由DNA变性、引物退火和反应延伸三个步骤完成的。图中设定的反应参数是94℃变性1min, 60 ℃退火1min, 72 ℃延伸1.5min。如此周而复始,重复进行,直至扩增产物的数量满足实验需求为止

PCR反应中的主要成份 1. 引物 2. 4种三磷酸脱氧核苷酸(dNTP) 3. Mg2+ 4. 模板 5. Taq DNA聚合酶 6. 反应缓冲液

实验仪器 电泳仪

琼脂糖凝胶电泳槽

PCR仪

凝胶成像系统

移液器

实验材料 1、DNA模板 2、4种dNTP 3、引物1、引物2 4、Taq酶 5、琼脂糖 6、DNA相对分子质量标准物 7、吸头、50ul PCR管

试剂 10×PCR缓冲液(含Mg2+) 4×dNTP (每种1mmol) Tag酶 1U/ul DNA模板 引物1: 5`- GGGGAATTCATGGTGAGCAAGGGC-3` 引物2: 5`-GACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGC-3` 引物溶液浓度 10pmol/ul

实验步骤 在0.5ml RCR管内配置20ul反应体系: CK(ul) 1#(ul) 模板 1 引物1 0.4 引物2   CK(ul) 1#(ul) 模板 1 引物1 0.4 引物2 10× PCR Buffer 2 Taq酶 0.5 dNTPs ddH2O 14.3 15.3 Total 20

PCR反应程序 (1) 94℃变性5min, (2) 94℃变性1min, (3) 52 ℃退火1min, (4) 72 ℃延伸1min。 (5) 重复(2)-(4)30次 (6)72 ℃延伸1min。

PCR结果。1、对照(无模板);2-6、PCR产物(5ul样品) 实验结果 PCR结果。1、对照(无模板);2-6、PCR产物(5ul样品)

思考题 进行一次成功的PCR反应顺注意哪些问题