实验五 单核苷酸多态性的检测 一、实验目的 1.了解SNP的概念及其作为新型分子标记的应用。 2.了解SNP检测的技术及原理。
二.实验原理 1.SNPs的概念 单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism, SNPs）是指在基因组水平上由于单个核苷酸位置上存在转换、颠换、插入、缺失等变异所引起的DNA序列多态性。 在一个群体中，当基因组内特定核苷酸位置上存在两种不同核苷酸且出现频率大于1％（也有人提出2％）时，被视作SNP。由于这种界标数目极多，覆盖密度大，由此可以大大提高基因组作图和基因定位的精度。
2.单核苷酸多态性检测与分析 变性高效液相色谱(DHPLC)：高效、快速、高灵敏度、低成本、全自动化操作 基于凝胶电泳的限制性片段长度多态性（RFLP） 等位基因特异的寡核苷酸杂交（ASO） 单链构象多态性（SSCP）分析 以荧光共振能量传递为基础的Taqman法 DNA芯片、质谱法、微测序法等。 CEL1酶（环球基因公司，Transgenomics, Inc.) 能识别单碱基错配，也被应用于SNP的检测。
3. SNPs检测在分子遗传学中的应用 Targeting Induced Local Lesions IN Genomes (TILLING) 反向遗传学 定做突变体 收单株，各自提DNA
如果PCR产物经变性复性后有错配的碱基对（也就是说有人们想要的突变体）： 酶切结果会提示 组织化，用户只需提交想研究的基因的引物序列
4. 本实验原理 本实验利用聚丙烯酰胺电泳，观察拟南芥不同生态型中某基因片段的SNP。根据测序结果，拟南芥不同生态型Ws和Col的At5g62130片段分子量大小相同，但存在单一位点的差异，而这种差异用常规的琼脂糖凝胶电泳无法区分。 在实验中，首先利用PCR扩增拟南芥At5g62130片段基因。然后对PCR产物进行变性和复性后，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。由于SNPs的存在，Ws、Col 及Ws和Col杂交F1代中At5g62130扩增片段经变性和复性后，因其构象不同，故可根据其泳动速率的差异而加以区分。
Fig. Typical band patterns of duplex analysis markers of different loci. Generation of co-dominant PCR-based markers by duplex analysis on high resolution gels The Plant Journal 1998, 16 ( 1): 117
三、实验材料与试剂 1．拟南芥小苗：C0，Ws； 2．CTAB提取缓冲液：100mM Tris-Cl (pH 8.0), 20mM EDTA (pH 8.0), 1.4M NaCl, 2% (w/v) CTAB 3．氯仿、异丙醇、75％乙醇，无菌水等； 4．PCR引物、PCR反应试剂，包括PCR buffer、dNTP 、Taq酶等。 5．14％聚丙烯酰胺凝胶、DNA上样缓冲液、DNA分子量Marker、TBE电泳缓冲液、EB染色液等。
四 实验步骤 采用CTAB法提取不同生态型（C0、WS）拟南芥基因组DNA。 1）取1~2株小苗，加入50l预热CTAB提取液，在离心管中用玻棒磨成匀浆，再加入350l CTAB溶液，继续研磨。65ºC水浴0.5hr。 2）冷却至室温后加入等体积氯仿400l，上下颠倒混匀，12000rpm，离心10min。吸取上清，移入另一管中。 3）加入1ml预冷的无水乙醇，混匀后-20ºC放置15min。12000rpm，离心15min。 4）倒去上清，沉淀用1ml 75％乙醇清洗，略离心后，小心倒去上清，将沉淀空干。 5）用20l H2O或TE缓冲液溶解沉淀。
2. PCR扩增拟南芥基因At5g62130片段。 模板为拟南芥不同生态型C0或Ws小苗的基因组 DNA 1 l 试剂 加样量 引物（10M） 0.5l0.5l PCR buffer 2l dNTP(25mM) Taq 0.2l ddH2O 13.8l 模板 1l 共计 20l 模板为拟南芥不同生态型C0或Ws小苗的基因组 DNA 1 l
PCR反应程序： PCR产物长度为1057bp 。
3．PCR产物的变性和复性: 1. 取PCR产物10 l （Co）+ 10 l （Ws），94ºC变性5min，42ºC复性30min。 2. 14％聚丙烯酰胺电泳，200V，1hr，电泳缓冲液为0.5×TBE。 3.电泳完毕后，凝胶用0.5g/ml EB的TBE溶液进行染色15min，在紫外灯下观察条带。 4.拍摄电泳结果，标明每个泳道的样品，简要说明形成这些条带差异的原因。 5.思考题：简述SNP检测在反向遗传学研究中的应用。
1057bp