C2-10 SNP Genotyping 服務 Primer 設計-快速入門 請按F5 進行播放 C2-10 SNP Genotyping 服務 Primer 設計-快速入門 2015.7.30 本檔案僅提供簡單的流程說明，詳細的操作說明請參考使用手冊，建議可先閱讀”第0章節-前言”部分。 跳至目錄

準備工作 NCGM-SNP組SNP鑑定服務係採用美商SEQUENOM MassARRAY® System，此平台可供用戶選擇較彈性的樣本數及任意數目的SNPs申請鑑定實驗。此平台的特點在於可於單一well中進行多個SNPs的鑑定實驗，但哪些SNP可於同一well內進行鑑定實驗以及單一well內最多可進行多少個SNPs，這些都取決於該批SNPs的primer設計結果，而primer設計的結果將決定該批實驗的所需費用(分成幾組反應進行以及總primer費用)。因此當primer設計完畢時，即可進行實驗費用精算，之後便可申請所需點數。申請鑑定實驗及訂購SNP primer時，LIMS系統將會確認該計畫是否有足夠點數之後，方可進行申請動作，故各用戶於SNP鑑定實驗進行前所需準備的前置工作有3項: 1. 建立LIMS帳號及申購點數。 (請參考申請說明) 2. SNP primer設計&訂購。 3. 準備樣本。

完成樣本QC、Primer 已到貨、有足額點數 實驗完成後LIMS寄發實驗結果下載通知信 新用戶服務申請流程圖 參加服務前使用說明會 時程 申請LIMS帳號 點數 5~14工作天 申請NCGM project及點數 統一星期四設計， 隔週星期一出訂單 可分別或同時進行 準備SNP primer 設計& 訂購 1. 用戶挑選欲鑑定的SNP位點 2.下載SNP序列 3. 檢查SNP是否適合進行鑑定 4. 進行SNP primer 測試設計 5.訂購已測試完成的SNP primer 準備樣本並申請送樣 申請新樣本 QC實驗 Primer訂購 ：兩週 樣本 primer 完成樣本QC、Primer 已到貨、有足額點數 實驗進行 ： 兩週 實驗申請 申請SNP鑑定 實驗完成後LIMS寄發實驗結果下載通知信

SNP primer 設計、訂購 流程 1 2 3 4 挑選SNP & 下載序列 Genepipe 費用估算 NCGM首頁 請依序完成步驟1~4的操作，請點選綠色方塊看各流程簡要說明，點選網頁超連結，開啟相關網頁 挑選SNP & 下載序列 1 使用Genepipe 下載SNP序列，以便設計及檢查之用 SNP序列 檢查 檢查SNP是否適用Sequenom平台 2 C-10 使用手冊 網頁超連結 Genepipe 費用估算 Primer 測試設計 使用LIMS 的primer Design Test 功能，查看設計後的primer 分組結果，估算所需費用 3 NCGM首頁 NCGM-LIMS 訂購已確認的primer 組合 使用已完成測試設計的SNP序列檔案及參數，於每周四中午前完成訂購申請 4 聯絡SNP組

SEQ Tool 1. 下載序列 可直接貼上SNP list 或上傳.txt 清單 1 2 選擇物種類別 3 可直接貼上rs ID 清單 設定序列長度，建議100~200 1 2 3 4 1. 下載序列 前往Gene Pipe 選擇序列資料方向 5 標示其他鄰近SNP點，必選 6 標示的範圍至少70~100 7 若鄰近的SNP有DIP 導致無法下載， 可選勾此項，不標示鄰近的DIP ， 如非必要，建議預設不要選勾! 8 9

1. 點選下載CSV檔並開啟檔案 1 下載序列 將 A1欄位的Variation 改成SNP後存檔 2

SNP primer 設計、訂購 流程 1 2 3 4 挑選SNP & 下載序列 Genepipe 費用估算 NCGM首頁 使用Genepipe 下載SNP序列，以便設計及檢查之用 SNP序列 檢查 檢查SNP是否適用Sequenom平台 2 C-10 使用手冊 網頁超連結 Genepipe 費用估算 Primer 測試設計 使用LIMS 的primer Design Test 功能，查看設計後的primer 分組結果，估算所需費用 3 NCGM首頁 NCGM-LIMS 訂購已確認的primer 組合 使用已完成測試設計的SNP序列檔案及參數，於每周四中午前完成訂購申請 4 聯絡SNP組

MySequenom 檢查說明 2. SNP檢查 若因序列特質(高度重複)，導致無法設計出專一性高的primer，經PCR反應後，則可能產生許多非原本預期的PCR產物，可能會有false positive 的訊號產生，將會造成誤判。因此檢查序列是否能設計出合適的primer 則是實驗前的重要動作。Sequenom官方的MySequenom 網站則提供此項檢查功能(類似UCSC 的In-Silico PCR)，檢查的功能主要是用來排除預期成功率會偏低或造成誤判的SNP。

申請SNP檢查:登入LIMS→選擇Working project →點選Service→Primer Service 1 申請SNP檢查:登入LIMS→選擇Working project →點選Service→Primer Service 2 點選此功能 2. SNP檢查

2. SNP檢查 1 選擇csv 檔 2 預覽結果

2. SNP檢查 1 瀏覽 csv檔 已經有資料的SNP 尚需檢查的SNP

2. SNP檢查 在網頁下方按下此鈕提出檢查申請

查看SNP檢查結果:登入LIMS→選擇Working project →點選Service→Primer Service 1 查看SNP檢查結果:登入LIMS→選擇Working project →點選Service→Primer Service 2. 2 點選此功能 SNP檢查

2. SNP檢查 沒有link 表尚待進行中

2. SNP檢查 下載 2 1 點選 3 已完成檢查會出現下載link 點選失敗結果檔

2. SNP檢查 點選查看結果

MySequenom 檢查結果欄位說明 SNP_ID H.TRUE H.FALSE H.NULL H.PCR2 H.PCR1 CONF 2. 欄位名稱 涵義說明 SNP_ID 上傳檔案中的SNP名稱 H.TRUE 此數值指的是設計完成的PCR primer 於genome中可以夾出的PCR產物數量，且PCR 產物包含有可被 extension probe 黏合的有效序列，合理的檢查值應為1，大於1表示可能會有錯誤實驗結果產生。 H.FALSE 此數值指的是設計完成的PCR primer 於genome中可以夾出的PCR產物數量，且PCR產物包含有可被 extension probe 黏合的無效序列。合理的檢查值應為0，大於0表示有錯誤的結果產生。 H.NULL 此數值指的是設計完成的PCR primer 於genome中可以夾出的PCR產物數量，但PCR產物並不含有可被 extension probe 黏合的序列。理想的檢查值應為0，大於0則可能降低反應效率，但不影響實驗正確性。 H.PCR2 在genome中upstream primer 可黏合的位置數。 H.PCR1 在genome中downstream primer 可黏合的位置數。 當H.PCR 1或2的數值遠大於100，則此現象可能會嚴重降低此SNP的表現。 CONF 此SNP執行於Sequenom平台的信心指數。此數值僅考慮uniplex的下所估算的結果。 2. SNP檢查

該SNP於Sequenom平台的適用指數。 MySequenom SNP分析案例 產生正確訊號的PCR pimer target 不會產生正確訊號的PCR pimer target PCR pimer target 該SNP於Sequenom平台的適用指數。 SNP_ID H.TRUE H.FALSE H.NULL H.PCR2 H.PCR1 CONF 實驗 平均成功率 rs7400583 1 21 151 11989 0.22 rs261253 2 34 2210 0.56 70 rs316401 71 40 0.92 99 2. SNP檢查 ●因為primer 專一性不佳，不應該進行鑑定的SNP ●一般正常的檢查結果 MySequenom 檢查結果說明： 1.建議刪除 error code 190 及 H.FALSE檢查值>0的SNP，再進入下一步的primer design test，因為即使可以成功設計primer，也極可能是False positive的結 果。 2.檢查結果僅是以uni-plex 狀況下進行理論計算所得的結果，未考慮 multi- plex的情況。因此也會發生 CONF 數值正常，實驗成功率缺偏低的現象，這有 可能是multi-plex情況下其他primer干擾所造成的結果。

SNP primer 設計、訂購 流程 1 2 3 4 挑選SNP & 下載序列 Genepipe 費用估算 NCGM首頁 使用Genepipe 下載SNP序列，以便設計及檢查之用 SNP序列 檢查 檢查SNP是否適用Sequenom平台 2 C-10 使用手冊 網頁超連結 Genepipe 費用估算 Primer 測試設計 使用LIMS 的primer Design Test 功能，查看設計後的primer 分組結果，估算所需費用 3 NCGM首頁 NCGM-LIMS 訂購已確認的primer 組合 使用已完成測試設計的SNP序列檔案及參數，於每周四中午前完成訂購申請 4 聯絡SNP組

選擇working project 3. 測試設計 按下OK 選擇欲操作的working project 登入LIMS NCGM以四位數的NGC PID作為您申請基因型鑑定服務時的代號，包括樣本盤號及實驗結果檔案等的命名均以此四位數PID為依據 ，在您登入系統後，請務必確認並正確點選您欲進行實驗的NCGM Project 作為您的“Working Project”，再繼續進行專屬該Project的服務申請或資料查詢等動作 3. 測試設計 登入LIMS 前往NCGM-LIMS 選擇欲操作的working project 1 按下OK 2

選擇working project 3. 點選Service 可看到多項服務功能 測試設計 進入working project的畫面 NCGM以四位數的NGC PID作為您申請基因型鑑定服務時的代號，包括樣本盤號及實驗結果檔案等的命名均以此四位數PID為依據 ，在您登入系統後，請務必確認並正確點選您欲進行實驗的NCGM Project 作為您的“Working Project”，再繼續進行專屬該Project的服務申請或資料查詢等動作 點選此處可更換working project 3. 進入working project的畫面 點選Service 可看到多項服務功能 測試設計 前往NCGM-LIMS

進行primer測試設計: 登入LIMS→點選Service→Primer Service→Primer Design Test 1 3. 測試設計 選擇primer設計類別 2 選擇設計plex數的上下限 3 上傳 snp 序列 CSV檔 4 前往NCGM-LIMS 預覽上傳資料 5

Plex Type 上下限說明 【iPLEX】 plex 上限選擇為 1~12plex時，採用iplex 低plex的設計參數。 plex 上限選擇為13~24plex時，採用iplex中plex的設計參數。 plex 上限選擇為25~36plex時，採用iplex高plex的設計參數。 這些plex參數的改變，會影響設計軟體其他參數的上下限設定，進而影響SNP primer的理論成功率高低，就理論上，低plex的設計參數相對嚴謹，而高plex的設計參數相對寬鬆，但不代表高plex的設計出來的primer 成功率一定會比低plex的設計參數來的低，成功率還是由實際的實驗結果才能決定，且plex 數的選擇尚得由分組結果考量所需經費。一般而言，當設計結果的組數相同時，會建議採用較低的plex上限，如欲設計36 SNPs，採用iplex高plex的設計參數設計後，分成30-plex+6-plex的組合，而採用iplex中plex的設計參數設計後，分成24-plex+12-plex的組合，兩者的分組組數相同(皆為兩組)，則所需的實驗費用相等，但採用中plex的設計參數可以降低同一well 內鑑定的SNP數，可以降低 primer 互相干擾的可能性，理論上可以提高成功率及正確性。 此外，設定plex下限可用於限制並排除過低plex數的assay組合，例如：排除低1~3-plex等低plex 組合。 另外，改變CSV檔的SNP順序，設計結果可能會有不同的assay 組合出現。 3. 測試設計

確認無誤後，按下確認，即完成測試，設計完畢 系統會自動寄發設計完成通知信。 3. 測試設計 注意：可使用Primer 設計結果來估算所需費用，對設計結果有任何問題，歡迎來電詢問。TEL:02-27825258分機4337

Primer 測試設計完成後 查看設計結果是否滿足需求:分成幾組、幾plex、是否有SNP 設計失敗，若不滿意設計結果，看看是否有其他的取代的SNP點，再重新抓取序列，檢查是否適合Sequenom 平台鑑定，最後再重新設計直至設計結果符合需求。 依據測試設計結果的分組數據精算實驗費用，再進行點數申購。 3. 測試設計

查看設計結果: 登入LIMS→點選Service→Primer Service→Query Primer Design Test 1 2 設計結果 ，請參考”使用手冊“第31頁 3. 測試設計 3

依照primer 測試設計輸入分組結果，再按下估算 輸入樣本盤數 1 依照primer 測試設計輸入分組結果，再按下估算 2 3 估算結果: 若已做過樣本QC，可排除QC費用。 若樣本盤大於4盤，primer 費用需再增加 4 點選IPLEX SNP 5 計算實際所需點數後，可進行點 數申購流程，請參考申請說明 3. 費用試算 前往NCGM首頁  

SNP primer 設計、訂購 流程 1 2 3 4 挑選SNP & 下載序列 Genepipe 費用估算 NCGM首頁 使用Genepipe 下載SNP序列，以便設計及檢查之用 SNP序列 檢查 檢查SNP是否適用Sequenom平台 2 C-10 使用手冊 網頁超連結 Genepipe 費用估算 Primer 測試設計 使用LIMS 的primer Design Test 功能，查看設計後的primer 分組結果，估算所需費用 3 NCGM首頁 NCGM-LIMS 訂購已確認的primer 組合 使用已完成測試設計的SNP序列檔案及參數，於每周四中午前完成訂購申請 4 聯絡SNP組

訂購SNP primer前必須先完成MySequenom 檢查，若系統中沒有該SNP的檢查資料，將無法進行訂購。 建議訂購前，請先進行primer Design Test確認設計結果是否合乎貴單位之需求，低plex 數的實驗費用相對較貴(以SNP /sample而言)，請評估低plex group 的必要性。 若Primer Design Test 的測試結果滿足貴單位的需 求，欲訂購該次設計結果的SNP primer組合。則訂 購時，請上傳該次的序列檔與設計參數，請勿變 更設計參數及上傳序列，否則設計結果可能會有 所不同。 初次訂購的SNP primer 預設管數為1，如欲變更訂購管數，請使用Manage Order功能。 若對Primer 設計有任何疑問，歡迎來電詢問 TEL:02-27825258 分機 4337 SNP組 4. 訂購primer

訂購 primer: 登入LIMS→點選Service→Primer Service→Upload DNA Sequence 選擇設計plex數的上下限，可參考下頁之說明 選擇平台類別 首次訂購固定為100nm，如欲變更訂購管數，請使用Manage Order功能 選擇樣本種類 選擇序列CSV檔 訂購SNP primer 1 2 前往NCGM-LIMS 3 4 5 6 NCGM於每週四中午 12:00截止當週Primer設計的申請，並於週四下午統一進行Primer設計，下週一中午發出Primer訂單。

Plex Type 上下限說明 【iPLEX】 plex 上限選擇為 1~12plex時，採用iplex 低plex的設計參數。 plex 上限選擇為13~24plex時，採用iplex中plex的設計參數。 plex 上限選擇為25~36plex時，採用iplex高plex的設計參數。 這些plex參數的改變，會影響設計軟體其他參數的上下限設定，進而影響SNP primer的理論成功率高低，就理論上，低plex的設計參數相對嚴謹，而高plex的設計參數相對寬鬆，但不代表高plex的設計出來的primer 成功率一定會比低plex的設計參數來的低，成功率還是由實際的實驗結果才能決定，且plex 數的選擇尚得由分組結果考量所需經費。一般而言，當設計結果的組數相同時，會建議採用較低的plex上限，如欲設計36 SNPs，採用iplex高plex的設計參數設計後，分成30-plex+6-plex的組合，而採用iplex中plex的設計參數設計後，分成24-plex+12-plex的組合，兩者的分組組數相同(皆為兩組)，則所需的實驗費用相等，但採用中plex的設計參數可以降低同一well 內鑑定的SNP數，可以降低 primer 互相干擾的可能性，理論上可以提高成功率及正確性。 此外，設定plex下限可用於限制並排除過低plex數的assay組合，例如：排除低1~3-plex等低plex 組合。 另外，改變CSV檔的SNP順序，設計結果可能會有與原本的測試結果不同。 4. 訂購primer

可用盤數說明 25nm規格可使用盤數(僅於續訂時提供) 100nm規格可使用盤數（首次與續訂皆可） 4~8 11~22 3~6 7~14 [iPLEX] 由於MALDI-TOF儀器特性，導致primer消耗量不一致，但實驗前無法得知哪些SNP primer 需要加倍使用，因此LIMS會先將所有primer以兩倍使用量來計算可用盤數，當實驗完成後，系統會扣除實際使用量後，再以現有剩餘體積換算可用盤數，因此若要節省primer 費用可分次申請實驗。 4. 訂購primer UEP分 子 量 (M.W.) 25nm規格可使用盤數(僅於續訂時提供) 100nm規格可使用盤數（首次與續訂皆可） 使用次數的限制與保存期限 小於 5475 4~8 11~22 次數不限/三年 大於等於5475但小於6650 3~6 7~14 大於等於6650但小於7750 2~4 6~12 大於等於7750 1~2

顯示訂購完成訊息，PRIMER到貨後，LIMS 會寄發到獲訊息，屆時方可使用LIMS 申請SNP 鑑定實驗 , 請參考使用手冊第4章節-申請樣本送樣及申請實驗操作說明。 4. 訂購primer

SNP primer 設計、訂購 流程 1 2 3 4 挑選SNP & 下載序列 Genepipe 費用估算 NCGM首頁 使用Genepipe 下載SNP序列，以便設計及檢查之用 SNP序列 檢查 檢查SNP是否適用Sequenom平台 2 C-10 使用手冊 網頁超連結 Genepipe 費用估算 Primer 測試設計 使用LIMS 的primer Design Test 功能，查看設計後的primer 分組結果，估算所需費用 3 NCGM首頁 NCGM-LIMS 訂購已確認的primer 組合 使用已完成測試設計的SNP序列檔案及參數，於每周四中午前完成訂購申請 4 聯絡SNP組