第六章 DNA重组的操作 第一节 DNA的体外重组 第二节 重组体导入受体细胞的原理与技术 第三节 重组子的筛选和鉴定
第一节 DNA的体外重组 外源DNA 载体DNA 连接 重组分子 转化或转导 电穿孔或显微注射 真核细胞 原核细胞 受体细胞 表达 扩增或表达 表达
第一节 DNA的体外重组 一、黏性末端的连接 二、平末端的连接 三、PCR产物的连接 四、Gateway载体构建系统
第一节 DNA的体外重组 一、重组DNA的概念和目的 重组DNA是来源不同的DNA在体外结合在一起从而形成的新的DNA分子Recombinant DNA 形成重组DNA的目的有三个： (i)形成新的蛋白产物 (ii)形成多拷贝的基因 (iii) 插入外源基因片段到新的物种中从而赋予其新的特性 重组DNA
第一节 DNA的体外重组 二、外源基因与载体的连接 1. 粘性末端连接（由同一种酶或同尾酶产生末端）
第一节 DNA的体外重组 二、外源基因与载体的连接 1. 粘性末端连接 （1）具有相同粘末端的DNA分子之间的连接 1. 粘性末端连接 （1）具有相同粘末端的DNA分子之间的连接 使用碱性磷酸酶处理载体DNA，去掉其5’末端的磷酸基，以防质粒DNA的自身环化 。
第一节 DNA的体外重组
第一节 DNA的体外重组 二、外源基因与载体的连接 1. 粘性末端连接 （2）具有不同粘性末端的DNA分子之间的连接 HindIII 1. 粘性末端连接 （2）具有不同粘性末端的DNA分子之间的连接 HindIII EcoRI 对基因酶切 HindIII EcoRI 对载体酶切 质粒载体的定向重组
第一节 DNA的体外重组 二、外源基因与载体的连接 2. 平头末端连接 5’端与3’端并列靠近的时间太短，不容易被连接酶连接。 2. 平头末端连接 （1） 直接连接 5’端与3’端并列靠近的时间太短，不容易被连接酶连接。 T4 DNA连接酶虽然能连接平末端，但效率很低，只有粘性末端的1%。 5’ P- -OH 3’ 5’ P- -OH 3’ 3’ HO- -P 5’ 3’ HO- -P 5’ 5’ P- -OH 3’ 3’ HO- -P 5’
第一节 DNA的体外重组 二、外源基因与载体的连接 2. 平头末端连接 （2） 人工加尾形成 “粘性末端” a）同聚加尾 法 非酶切位点
第一节 DNA的体外重组
第一节 DNA的体外重组 二、外源基因与载体的连接 2. 平头末端连接 （2） 人工加尾形成 “粘性末端” 2. 平头末端连接 （2） 人工加尾形成 “粘性末端” b）衔接物(linker)连接 Linker:用化学合成法合成的一段10-12bp的特定限制性内切酶识别位点序列的平端双链。 linker的作用：用T4 DNA连接酶连到平端DNA上，然后再用酶切，形成一个人工粘性末端。 GGAATTCC CCTTAAGG EcoRI linker：
第一节 DNA的体外重组 衔接物(linker)连接
第一节 DNA的体外重组 衔接物(linker)连接 优点： 1）可以用内切酶把插入片段切下来。 2）能给载体连接上Polylinker 缺点： 如果插入片段内部也有该酶位点，不能切下完整的插入片段
第一节 DNA的体外重组 二、外源基因与载体的连接 2. 平头末端连接 （2） 人工加尾形成 “粘性末端” 2. 平头末端连接 （2） 人工加尾形成 “粘性末端” c) DNA接头 (adapter)连接法 adapter: 有单链，也有双链。双链的一头平末端、另一头粘性末端（某种酶切位点序列）。 adapter的作用:用T4DNA连接酶连到DNA分子的两端，直接成为人工粘性末端。 5‘p-GATCCCGG-OH3’ GGCC-p5’ BamHI adapter
第一节 DNA的体外重组 c) DNA接头 (adapter)连接法 缺点：接头与接头会彼此以粘性末端接在一起，影响与DNA片段的连接。 防止自我连接：先用小牛肠碱性磷酸酶（CIP）处理接头，水解掉其5’端的磷酸，防止自我连接。 （以后再用T4多核苷酸激酶加上磷酸。）
第一节 DNA的体外重组 二、外源基因与载体的连接 3.PCR产物的连接 （1）在引物的5’端设计酶切位点 GCAGAATTC 互补序列 二、外源基因与载体的连接 3.PCR产物的连接 （1）在引物的5’端设计酶切位点 GCAGAATTC 互补序列 3’端15~20bp与模板互补； 5’端6~10bp是某个内切酶的识别序列 （5’端多余的3~5bp属保护碱基）
第一节 DNA的体外重组 模板 3’ 模板 -3’ 5’- GCAGAATTC 互补序列 EcoRI位点 复性 3’ 模板 5’- 引物1 5’- GCAGAATTC EcoRI位点 复性 3’ 模板 互补序列 5’- GCAGAATTC -3’ 延伸 3’ 模板 互补序列 PCR产物 5’- GCAGAATTC -3’
第一节 DNA的体外重组 模板 3’ 模板 3’ 互补序列 -5’ GCTAGCCGG 3-’ BamH I 位点 复性 模板 3’ 3’- 引物2 互补序列 GCTAGCCGG -5’ 3-’ BamH I 位点 复性 模板 3’ 互补序列 3’- GCTAGCCGG 延伸 模板 3’ PCR产物 互补序列 GCTAGCCGG
第一节 DNA的体外重组 二、外源基因与载体的连接 3. PCR产物的连接 （2）与T载体直接连接 二、外源基因与载体的连接 3. PCR产物的连接 （2）与T载体直接连接 Taq DNA聚合酶的特性：在DNA双链的3’端再加上一个多余的核苷酸（优先加A）,因此PCR产物两个3’端一般都有一个A T载体的两个3’端人为地各加一个T：利用Taq DNA聚合酶，当原料中只有dTTP时，被迫在平端载体上添加T！
第一节 DNA的体外重组 PCR产物 载体 dTTP dNTP Taq DNA聚合酶 A T A T T A T A
第一节 DNA的体外重组 二、外源基因与载体的连接 3. PCR产物的连接 （2）与T载体直接连接 T载体图
第一节 DNA的体外重组 二、外源基因与载体的连接 传统方法
第一节 DNA的体外重组 二、外源基因与载体的连接 4.Gateway 载体构建系统 利用λ噬菌体的位点特异性重组系统，在不进行酶切和连接的基础上实现基因快速克隆及载体间平行转移，有利于保持正确的开放阅读框和插入方向。
第一节 DNA的体外重组 二、外源基因与载体的连接 4.Gateway 载体构建系统
第一节 DNA的体外重组 二、外源基因与载体的连接 4.Gateway 载体构建系统
噬菌体位点特异性重组系统； 高效的实现DNA序列在多种载体系统的转移。 4、Gateway 载体构建系统 噬菌体位点特异性重组系统； 高效的实现DNA序列在多种载体系统的转移。 改造过的各种表达载体 入门克隆 在构建入门载体后，不再需要使用限制性内切酶和连接酶。一旦您拥有了一个入门克隆，就可以多次使用它，转移您的目的基因到Gateway改造过的各种表达载体
√ 4、Gateway 载体构建系统 （1）创建入门克隆 BP反应：attB+attP attL+attR，产物：入门克隆 入门克隆 改造过的各种表达载体 √ 在构建入门载体后，不再需要使用限制性内切酶和连接酶。一旦您拥有了一个入门克隆，就可以多次使用它，转移您的目的基因到Gateway改造过的各种表达载体
√ √ 4、Gateway 载体构建系统 （2）构建表达克隆 LR反应：attL+attR attB+attP，产物：表达克隆 入门克隆 改造过的各种表达载体 √ 在构建入门载体后，不再需要使用限制性内切酶和连接酶。一旦您拥有了一个入门克隆，就可以多次使用它，转移您的目的基因到Gateway改造过的各种表达载体 √
第一节 DNA的体外重组 三、DNA体外连接应注意的事项 1.插入片断与载体的酶切位点互补 相同的粘性末端才能有效地连接。 1.插入片断与载体的酶切位点互补 相同的粘性末端才能有效地连接。 尽量避免平端连接。 决不能进行非粘性末端连接。 EcoRI EcoRI EcoRI （1）用相同的酶切 （2）用同尾酶切 BamHI、BclI、BglII、Sau3AI、XhoII都产生GATC4个碱基的粘性末端。
第一节 DNA的体外重组 三、DNA体外连接应注意的事项 2. DNA插入的方向正确 用双酶切 由于产生的粘性末端不同，只能以固定方向连接。 EcoRI BamHI EcoRI BamHI BamHI EcoRI
第一节 DNA的体外重组 三、DNA体外连接应注意的事项 3. 插入基因的开放阅读框（ORF）正确 （1）DNA定向插入 （2）起始密码 （2）起始密码 尤其当载体上有ATG起始密码的时候，更要注意。 EcoRI EcoRI ATGGAATTC ATGCGGAATTCT 载体 插入片断 ATGGAATTC T 重组 但移码突变！
第一节 DNA的体外重组 三、DNA体外连接应注意的事项 （1）提高插入片断的用量 连接反应体系中，插入片断比载体多10倍以上。 4. 防止载体自身环化连接 （1）提高插入片断的用量 连接反应体系中，插入片断比载体多10倍以上。 （2）用碱性磷酸酶处理载体 载体切口的5’磷酸被除去，不能自我连接。但可以与插入片断以单链连接。
第一节 DNA的体外重组 四、载体和外源DNA插入片段的连接结果 1. 载体自身环化连接（能存活） 2. 载体之间互相连接（能存活） 3. 插入片段互相连接（不能存活） 4. 一个载体与几个插入片段重组（能存活） 5. 几个载体与一个插入片段重组（能存活）
第一节 DNA的体外重组