CHAPTER 2 Experimental Approaches for Studying Cells
OUTLINE 2.1 TECHNIQUES OF MICROSCOPY 2.2 TECHNIQUES OF CYTOCHEMISTRY 2.3 TECHNIQUES OF CELL SORTING 2.4 CELL ENGINEERING 2.5 TECHNIQUES OF ISOLATION 2.6 METHODS OF MOLECULAR BIOLOGY
普通光学显微镜
2.1 TECHNIQUES OF MICROSCOPY 2.1.1 The Light Microscope Resolving power,R 显微镜的数值孔径 (numeric aperture，NA) 放大率(magnification,M)
波长与分辨率
2.1.2 光镜标本制备技术 细胞染色技术 组织固定和切片技术 细胞化学技术 利用 Feulgen反应可特异性检测 细胞中DNA。
2.1.3 常用光学显微镜 ◆普通双筒显微镜 (binoular microscope) ◆荧光显微镜 (fluorescence microscope) ◆相差显微镜 (phase contrast microscope)
2.1.3 常用光学显微镜 ◆倒置显微镜 ■物镜与照明系统的位置颠倒。 2.1.3 常用光学显微镜 ◆倒置显微镜 ■物镜与照明系统的位置颠倒。 ■集光器与载物台之间的工作距离提高,可以放置培养皿、培养瓶等容器,直接对培养的细胞进行照明和观察。
倒置显微镜
2.2 电子显微镜 (Electron microscope) 1932年德国学者Max Knolls和Ernst Ruska用波长比光短得多的电子作光源,发明了第一台电子显微镜，大大提高了显微镜的分辨率，开拓了超微世界。
2.2.1 电子显微镜概述 电子显微镜的基本结构 电子显微镜基本结构由三大部分组成: ●电子光学系统由照明系统、标本室、 成像系统、观察窗和记录用的照相机等 组成； ●真空系统是保持电镜的真空度； ●电子学系统即供电系统，需要高压稳压。
透射电子显微镜
电子染色 元素的原子序数,原子序数越高,散射的电 子越多,反差就越大。生物分子是由一些原 子序数很低的轻元素(氢、氧、碳、氮等) 标本对电子的散射能力取决于其组成 元素的原子序数,原子序数越高,散射的电 子越多,反差就越大。生物分子是由一些原 子序数很低的轻元素(氢、氧、碳、氮等) 组成的,它们散射电子的能力很弱,在电镜 下几乎不存在明暗反差。为使生物样品加 大反差,就要进行染色,即用重金属增加电 子散射能力,称为电子染色。
电镜样品的制备
2.2.2 Transmission Electron Microscope ◆冰冻蚀刻术(freeze-etching) 是专门观察样品外表面的投影 复型术。
冰冻蚀刻技术
2.2.3 Scanning Electron Microscope 原理： 目前一般扫描电镜的分辨率约60～100 Å(6～10nm)。
扫描电镜
2.2.4 Scanning Tunneling Microscope,STM ◆基本原理
扫描隧道显微镜工作原理
2.2.4 扫描隧道显微镜 扫描隧道显微术在生命科学 中的应用 ◆DNA结构研究； ◆胶原、纤维和蛋白质结构研究； ◆细胞膜表面结构的研究。
扫描隧道电镜下的DNA双螺旋
2.3 TECHNIQUES OF CYTOCHEMISTRY 2.3.1 酶细胞化学技术 酶细胞化学技术就是通过酶的特异细胞化学反应来显示酶在细胞内的定位。 2.3.2 免疫细胞化学技术 免疫荧光技术 免疫电镜技术
2.4 Radioautography 放射自显影的原理是利用放射性同位素所发射出来的带电离子(α或β离子)作用于感光材料的卤化银晶体,从而产生潜影。这种潜影可用显影液显示,成为可见的“像”。因此,它是利用卤化银乳胶现象,检查和测量放射性的一种方法。
放射自显影术
2.5 分析细胞学技术 2.5.1 流式细胞术 (Flow cytometry) 流式细胞器 (Flow cytometer,FCM)
流式细胞术
细胞分选
细胞标记
染色体分选
染色体标记
2.6 细胞工程技术 (Cell Engineering) 2.6.1 细胞培养 体外细胞培养的条件 无血清培养∶ 环境因素∶ 无菌环境、合适的温度、一定的渗透 压和气体环境、O2和CO2。后者对于维 持细胞培养液的酸碱度十分重要。 代谢物和废物排除：
Knockout Mice 实验分三步∶ ◆构建重组体； ◆转基因敲除； ◆筛选。 The technique used to generate knockout mice was developed in the late 1980s by Marlo Capecchi at the University of Utah. 实验分三步∶ ◆构建重组体； ◆转基因敲除； ◆筛选。
基因敲除
基因敲除示意图（1）
基因敲除示意图（2）
基因敲除原理
Knockout Mice
未来的生物技术