第十三单元 （综合型实验）

实验一 酶联免疫吸附实验检测 伤寒O抗体方法的建立 （综合性实验）

实验原理 检测伤寒O抗体在伤寒菌感染的诊断中具有重要意义，采用肥达反应可对抗体进行半定量检测；若采用新一代的免疫检测技术建立对伤寒O抗体准确定量检测的法，则可提高临床诊断效果。以伤寒O抗原免疫动物，制备出抗伤寒O的抗体，将后者纯化抗体与酶连接制备成酶标抗体;以伤寒O抗原包被酶标板，制备伤寒酶标抗体为竞争抗体，以竞争法检测伤寒抗体酶联免疫检技术。

实验材料 1. 伤寒沙门菌菌体“O”抗原（免疫用） 2. 伤寒沙门菌可溶性菌体“O”抗原（包备用） 3. 饱和硫酸铵溶液 4. 酶标用洗涤液 5. 酶标用稀释液 6. 酶标用底物液 7. 酶标用终止液 (2mol/L H2SO4 ) 8. 伤寒“O”抗原包被酶标板 9. 待检血清标本　 10.实验室标准阳性血清 11.ELISA读数仪　

实验流程 制备抗伤寒O抗体和O抗原 抗体纯化 酶(HRP)标记抗体 竞争ELISA检测伤寒O抗体条件的优化 标准曲线确定 标本检测与结果判断

实验方法 伤寒沙门菌菌体“O”抗原（免疫用） 取伤寒沙门菌标准菌株（伤寒沙门菌O901）的典型光滑型菌落，密集划线接种于普通琼脂平板，37℃　培养24h，用无菌生理盐水洗下菌苔，移入无菌的三角烧瓶中。充分振摇，置100℃　水浴1h，杀菌及破坏H抗原。菌悬液离心，4000r/min，10min，弃上清。菌体再用无菌生理盐水洗涤，弃上清。无活菌试验合格后，用无菌生理盐水稀释成8~10亿／ml，即成伤寒沙门菌“O”菌体抗原。

伤寒沙门菌可溶性菌体“O”抗原（包备用） 取伤寒沙门菌O901接种于普通琼脂平板，37℃　培养24h，用无菌生理盐水洗下菌苔，配成70~100亿/ml菌悬液，隔水煮沸2h，离心，3500r/min，10min，取上清即伤寒沙门菌可溶性菌体“O”抗原。 表1 制备细菌免疫血清的免疫程序 日期 第1天 第2天 第3天 第4天 第5天 抗原剂量（ml） 0.1 0.2 0.3 0.5 1.0 途径 多点皮内 耳缘静脉

抗体制备 制备抗伤寒O抗体 推荐快速免疫方案供参考采用（表1）：取已制备的伤寒沙门氏菌体O抗原（１０亿／ml），免疫程序如下表。最后两次注射剂量较大，要缓慢推注。在末次免疫2天后试血，采用直接凝集法测定效价（见第二单元）。如凝集效价大于1∶1280，则可于一周后放血。效价过低，可再加强注射。 表1 制备细菌免疫血清的免疫程序 日期 第1天 第2天 第3天 第4天 第5天 抗原剂量（ml） 0.1 0.2 0.3 0.5 1.0 途径 多点皮内 耳缘静脉

抗体的纯化与酶标记 1份免疫血清加1份生理盐水，边搅拌边滴加2份饱和硫酸铵溶液，于4℃静置2h，2000r/min离心20 min，吸弃上清，将沉淀溶于适量生理盐水（尽量保持高蛋白浓度），放置透析袋中，多次更换生理盐水(透析液)，得初步纯化的免疫抗体。采用改良NaIO4标记法将酶与抗体的连接，其他备选的标记方法请参考单元一。

改良NaIO4标记法将酶 取5 mg HRP溶于0.5 ml双馏水中，加入新配制的0.06 M NaIO4水溶液0.5 ml，混匀，4 ℃ 30 min； 再加入0.16 M乙二醇水溶液（10 ml H2O+0.09 ml乙二醇）0.5 ml，室温放置30 min。 然后加入含5 mg纯化抗体的水溶液1 ml，混匀，并装入透析袋，于0.05 M pH 9.5碳酸盐缓冲液中搅拌透析6 h（或过夜），使之结合； 加入NaBH4溶液（5 mg/ml）0.2 ml，混匀，4 ℃ 2 h； 最后缓慢加入等体积的饱和硫酸铵溶液，混匀，4 ℃ 30 min，离心，去上清，以0.02 M pH 7.4 PBS液溶解沉淀并4 ℃透析除盐过夜； 次日取出离心，去除沉淀，即得酶-抗体（HRP-IgG）结合物，以0.02 M pH 7.4 PBS液加至5 ml。

抗竞争法酶标抗体工作浓度的确定 ①将酶标抗体用稀释液做系列稀释，加入包被有伤寒抗原的酶标板中（50μl/孔），37℃ 30min。 ②洗涤液充分洗涤3次，甩干。 ③各孔内加底物液0.1ml，置暗处20 min。 ④各孔内加入终止液终止反应。 ⑤用酶标仪检测OD值。 以OD值在0.８左右的最小稀释倍数为待检样本的最佳稀释倍数。

标准曲线的制备 ①从5倍开始用酶标稀释液进行系列倍比稀释（连续稀释10个管），与确定工作浓度的酶标抗体一同加入包被有伤寒抗原的酶标板中，另在2孔中加入稀释液作空白对照，置37℃恒温箱30 min。 ②取出用洗涤液充分洗涤3次，甩干。 ③各孔内加底物液0.1ml，置暗处20 min。 ④各孔内加入终止液终止反应。 ⑤用酶标仪检测OD值。 空白对照OD值在0.8左右实验成立，以标本OD值在0.8～0.05的稀释度（抗体单位）作为标准品的工作范围，根据对标准抗体血清所测得的OD值，在方格纸上以OD值为x轴，抗体单位为Y轴绘制标准曲线。

标本检测 按预试验摸索的实验条件进行测定： ①将标准血清进行系列倍比稀释（连续稀释10个管）。 ②将待检血清用酶标稀释液适当稀释。 ③稀释液作空白对照。 ④将稀释的酶标抗体（50μl/孔），同待检标本、不同单位的标准血清和空白对照标本一同加入包被有伤寒抗原的酶标板中（50μl/孔）。 ⑤置37℃恒温箱30 min。 ⑥加底物，终止反应后检测OD值。

结果判定 阳性标本反应孔不显色，空白标本反应孔显色说明实验成立。根据对标准抗体血清所测得的OD值和其所对应的抗体单位标绘制准曲线或建立的回归方程，根据绘制的准曲线求出每个标本的抗体单位。

实验讨论 吉林医药学院 李妍 1. 请就方法学评价肥达反应和竞争ELISA法检测伤寒“O 抗体”。例如，方法的稳定性、特异性和敏感性。 2. 人类与伤寒沙门菌接触密切，通常情况下伤寒抗体均阳 性。个体伤寒O抗体水平与伤寒感染和机体免疫状态有 关，因此建立群体伤寒O抗体水平的正常范围对判定个 体伤寒的感染和机体免疫状态具有重要价值。如何建立 新方法检测伤寒O抗体的参考范围（正常值）? 吉林医药学院 李妍

实验二 机体免疫功能评估 （综合性实验）

无胸腺的裸鼠是T细胞选择性缺陷的天然动物模型

人的重症联合型免疫缺陷综合征

实验原理 利用淋巴细胞敏感的细胞毒药物抑制或杀伤淋巴细胞，使机体免疫功能低下。给实验动物（小鼠）注射抗原，通过观察小鼠机体免疫抗体的反应水平评价机体的体液免疫水平。二硝基氟苯（DNFB）是一种半抗原，将其溶液涂抹腹壁皮肤后，与皮肤蛋白结合成完全抗原，刺激T淋巴细胞增殖成致敏淋巴细胞。4～7天后将其再次涂抹，可使局部产生迟发型超敏反应（水肿），通过观察迟发型超敏反应程度对小鼠机体的细胞免疫功能做出评价 。.鸡卵卵核蛋白抗原是天然的可溶性抗原，注入机体可诱导特异抗体产生，当免疫细胞受到抑制，B 细胞活化和抗体产生能力下降，检测特异性抗体产生可评价体液免疫功能。

实验材料 1. 免疫抑制剂 环磷酰胺，氢化可的松。 2. 免疫抗原 1%的二硝基氟苯（DNEB），鸡卵卵核蛋白。 1. 免疫抑制剂 环磷酰胺，氢化可的松。 2. 免疫抗原 1%的二硝基氟苯（DNEB），鸡卵卵核蛋白。 3. 酶标用洗涤液 ，稀释液，底物液，酶标用终止液（2mol/L H2SO4）。 4. 抗原包被的酶标板 用包被液将免疫用抗原稀释20倍加到酶 标板中，每孔0.1ml，置湿盒中4℃过夜；次日取出，用蒸 馏水充分洗涤3次，甩干备用。 5. 酶标仪 6. 酶标抗小鼠IgG抗体。 7. 抗体标准品 多支小鼠抗鸡卵卵核蛋白抗体的混合物。 8. 1ml注射器，采血用手术器械，分离血清用器材，天平， 绘图纸等。　

实验流程 基础免疫 实验分组 非免疫动物 对照组 造模组 空白组 抗原激发 迟发型超敏反应 （二硝基氟苯） 特异性抗体的诱发 （鸡卵卵核蛋白） 皮肤超敏反应观察 抗体效价测定

实验方法 基础免疫 1. 二硝基氟苯致敏: 将小鼠腹部去毛，范围约3×3cm2大小，并将１％DNFB溶液均匀涂抹于上。 2. 可溶抗原致敏: 取小鼠于大腿内侧注射卵核抗原0.2ml/只。抗原。

实验动物分组与免疫模型建立 将做过基础免疫的小鼠随机分成两组（造模组和实验对照组）；另取数量相等的未经免疫的小鼠为空白对照组。 造模组小鼠可采用以下方法之一诱导免疫抑制,也2方法均用,进行对比。 方法一: 每鼠腹腔注射环磷酰胺50mg/kg（参考剂量），连续5天后免疫功能显著降低。 方法二：每鼠每天腹腔注射氢化可的松50mg/kg（参考剂量），5天后免疫功能显著受抑。

迟发型超敏反应激发(细胞免疫功能检测) 致敏后第7天，将１％DNFB溶液10μl均匀涂抹于小鼠右耳（两面）进行攻击，空白对照组同样涂耳但未致敏。攻击后24 h，剪下左右耳壳，取同样大小的耳片，称重。 特异性抗体的诱发(体液免疫功能检测) 基础免疫后第7天再次注射抗原，方法同基础免疫。5-7天后采血测抗体。 在优化间接法检测小鼠抗卵核抗原的条件的基础上;采ELISA检测实验组和空白组小鼠特异抗体的浓度。

优化间接法检测小鼠抗卵核抗原的条件 ①将待检血清从5倍开始用酶标稀释液进行系列倍比稀释（连续稀释10个管），分别加入已用抗原包被好的酶标板中（每孔加0.1ml），置37℃恒温箱30 min。 ②取出用洗涤液充分洗涤3次，甩干。 ③各孔加酶标抗体0.1ml，置37℃恒温箱30 min。 ④取出用洗涤液充分洗涤3次，甩干。 ⑤各孔内加底物液0.1ml，置暗处20 min。 ⑥各孔内加入终止液终止反应。 ⑦用酶标仪检测OD值。 以OD值在0.30左右的最小稀释倍数为待检样本最佳稀释倍数。

优化间接法检测小鼠抗卵核抗体 ① 将待检血清按预实验确定的稀释倍数用酶标稀释液进行稀释，分别加入已用抗原包被好的酶标板中（每孔加0.1ml）。 ② 将标准血清进行系列倍比稀释（连续稀释10个管），分别加入已用抗原包被好的酶标板中（每孔加0.1ml）。 ③ 另在2孔中加入稀释液作空白对照。 ④ 置37℃恒温箱30 min。 ⑤ 洗涤，加酶标抗体，加底物，终止反应和检测OD值。

结果判断 1. 细胞免疫功能的判定 以剪下的左右耳片重量之差为迟发型超敏反应程度，可以反映机体细胞免疫水平。模型组免疫功能下降，迟发型超敏反应强度下降。

2. 体液免疫 根据对标准抗体血清所测得的OD值（标准血清及待检血清OD值在计算时均应减去空白对照OD值），在方格纸上以OD值为x轴，抗体单位为Y轴绘制标准曲线；或采用数学模型进行线性转化，建立回归方程。根据标绘制的准曲线或建立的回归方程，可以求出每个标本的抗体单位。模型组免疫功能下降，特异抗体产生下降。

实验讨论 1. 举例说明人体在哪些情况下发生免疫缺陷。 2. 针对本实验建立的模型，你还能想到哪些方法或指标来评价免疫功能？

实验三 免疫相关疾病的 实验诊断 （科研设计）

免疫学检验的与临床疾病 对自身免疫性疾病的诊断 对免疫增生性疾病的诊断 对感染性疾病的诊断 对机体免疫状态进行综合评价 肿瘤标志物对肿瘤进行早期诊断或病情监测

主要课程讨论安排 第一阶段: 重点是与临床医师和患者本人接触，或通过查 阅有关书籍和互联网增加对疾病和疾病的诊断过程的感 性认识; 第二阶段: 有针对性地、系统地收集有关临床实验诊断数 据和资料，作为分析和讨论的基础； 第三阶段: 对实验数据和资料进行总结分析并提出有关设 想或新的实验诊断方案； 第四阶段: 回到临床与临床医师或指导教师共同探讨有关 诊断的做出方案的合理性并形成文字材料，召开有专家 参加的讨论会或报告会。

选题 免疫学诊断的核心内容是利用实验的方法获得人体的免疫信息对疾病作出诊断。其研究内容包括实验系统研发；实验指标检测效果评价和实验指标信息解释等。课程选题来源于课程的学习，收集的临床资料和在实践中的感性认识。 可采取主动探索的讨论方式，综合运用所掌握的免疫学检测方法解决临床疑难问题，对选择的病例进行思考和提问，包括： （1）上述病例是否是典型病例，还需与哪些疾病相鉴别？ （2）上述病例是否可以通过临床表现做出诊断和鉴别诊断？单从临床表现做 出的诊断还有哪些不足？ （3）实验诊断在诊治上述病例中的作用（早期诊断、确定诊断、鉴别诊断、 观察病情等方面）。 （4）对机体的免疫系统状态进行评估的指标是否妥当，结论是否正确。 （5）建议临床医生应进一步作哪些实验检查？

对选择的实验指标围绕如下几个方面进行讨论： （1）实验指标所涉及的方法的敏感性及稳定性如何？ （2）指标用于诊断疾病的效果如何？（诊断特异性、诊断敏感性、预期值等）。 （3）多项指标联合使用的情况和分析方法。 （4）结合临床实际改进指标的可能性和途径。

实验设计 实验设计报告以开拓思维，强调科学性为主，参考以下几方面的内容： 1. 针对某一疾病提高有关诊断指标的敏感性或达 到早期诊断的目的。 2. 寻找新的、特异性强的标志物。 3. 对诊断界值进行探讨。 4. 多项指标联合分析的方法。

实验设计报告的内容与要求 题目：应重点突出，应涵盖实验目的，实验对象和方法。一般不超过20字。 前言 ：简要介绍研究的背景资料和问题的提出，说明实验目的。应重点阐述本实验的新颖性，应引用必要的参考文献。 技术路线 ：在宏观上阐述实验方案和技术流程。 材料与方法：具体说明实验所用的材料和方法，其详细程度应使读者按照说明可以进行实验，即具有可操作性。 可能结果和讨论：对实验可能的结果进行预测并进行有关的分析和讨论。 参考文献：将文中引用的参考文献具体列出作者，题目及出处。

实验设计报告会 聘请有关专家和指导教师参加，以小组为单位选出典型的实验报告在全班宜读（有条件应将实验设计制成多媒体幻灯进行讲演），由专家、指导教师和全班同学进行提问，由教师进行必要的指导和总结。

单元讨论一: 新型免疫实验诊断方法的建立和评价 肿瘤标记物的筛查在预测肿瘤发病风险、肿瘤早期诊断和预后判断等方面均有重要意义，请查阅资料，总结近年来用于卵巢癌诊断的新指标，就如下方面进行比较的评价。 新型免疫学方法主要是针对经典免疫学方法的不足而改进和建立的？ 目前新型免疫学方法的改进主要是针经典免疫学方法的哪些不足？ 评价新指标的优势，及其需要改建的方面？

单元讨论二： 评价机体免疫状态免疫评估指标的选择 免疫缺陷病概述

吉林医药学院 李妍 1. 对照上图，讨论正常机体的免疫能力是由多种不同的免疫机制协同所构成的。人类的自身免疫病包括那些？ 2.试讨论评价机体的免疫能力应包括哪些方面？具体的免疫评估指标有哪些？ 吉林医药学院 李妍