实 验 生 物 学 重组DNA技术与基因工程 华东理工大学 张惠展

重组DNA技术与基因工程 1 重组DNA技术与基因工程的基本概念 2 重组DNA技术所需的基本条件 3 重组DNA技术的操作过程 4 目的基因的克隆与基因文库的构建 5 外源基因在大肠杆菌中的表达 6 外源基因在酵母中的表达

1 重组DNA技术与基因工程的基本概念 A 重组DNA技术与基因工程概念辨析 重组DNA技术的定义 重组DNA技术是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。因此，供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本元 件。

1 重组DNA技术与基因工程的基本概念 A 重组DNA技术与基因工程概念辨析 基因工程的定义 基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技术）；而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞大规模培养、基因产物分离纯化、生物产品制造过程的工程化 （本讲座侧重于上游技术）。

1 重组DNA技术与基因工程的基本概念 B 重组DNA技术与基因工程的基本用途 分离、扩增、鉴定、研究、整理基因信息资源 规模化生产生物活性物质 设计、构建生物的新性状甚至新物种

分离、扩增、鉴定、研究、整理基因信息资源 从染色体DNA上定向分离目的基因 将获得的目的基因扩增至足够数量 采取加减法策略鉴定基因生物功能 gain of function loss of function 通过序列缺失研究基因内的功能域 根据同源基因序列整理生物进化树 GGTATCGTCATCTACTACGTGGCAAT

规模化生产生物活性物质 天然细胞 基因工程 采集 / 培养 蛋白质工程 途径工程 组织工程 基因工程 天然细胞 工程细胞 干细胞 工程干细胞 分离工程 发酵工程 分离工程 组织工程 细胞工程 酶 代谢工程 分离工程 酶工程 生物分子产品 组织器官 组织器官 生物分子产品

设计构建生物的新性状甚至新物种 天然物质或合成物质 野生细胞 突变细胞 基因敲除 基因导入 高通量筛选 野生动物 突变动物 基因敲除

1 重组DNA技术与基因工程的基本概念 C 基因工程的基本形式 第一代基因工程 蛋白多肽基因的高效表达 经典基因工程 第一代基因工程 蛋白多肽基因的高效表达 经典基因工程 第二代基因工程 蛋白编码基因的定向诱变 蛋白质工程 第三代基因工程 代谢信息途径的修饰重构 代谢途径工程 第四代基因工程 全基因组或染色体的操作 基因组工程

第一代基因工程：蛋白多肽基因的高效表达 经典基因工程 第一代基因工程：蛋白多肽基因的高效表达 经典基因工程 切 接 转 增 检

第二代基因工程：突变蛋白和融合蛋白定制 蛋白质工程 第二代基因工程：突变蛋白和融合蛋白定制 蛋白质工程 天然蛋白质编码序列 蛋白质功能域编码序列 突变蛋白 融合蛋白

第二代基因工程：全新蛋白设计 蛋白质工程 Nature 537 2016 天然存在蛋白 序列理论可能性20200种 定向进化蛋白 第二代基因工程：全新蛋白设计 蛋白质工程 Nature 537 2016 天然存在蛋白 序列理论可能性20200种 定向进化蛋白 天然存在序列1012种 全新设计蛋白

第三代基因工程：代谢信息途径的修饰重构 途径工程 第三代基因工程：代谢信息途径的修饰重构 途径工程 （合成生物学） 信号转导途径的遗传操作 物质代谢途径的遗传操作 FGF A 质膜 单基因操作 FGFR P 强化表达 / 导入基因 P B Grb2 P P 衰减表达 / 敲除基因 SOS 基 因 回 路 定点突变 / 基因洗牌 FRS C 基因回路 P Ras GDP GTP 多基因操作 MAPK MEK D 多模件重组 Raf P P P 多单链片段重组 核膜 E 转录机器全局工程 TF P P P F G

第四代基因工程：基因组工程 N. Annaluru et al. Science 344, 55, 2014 以野生型酿酒酵母第III号染色体的317kb序列为蓝本，作者设计并合成了一个273 kb长的功能性染色体模仿物synIII。改造内容包括：终止密码子的置换；亚端粒区、内含子、tRNA基因、转座子、交配位点a的删除及96个loxP元件的插入。这条人工设计和改造的染色体对细胞生长无损害，且表 现出多代遗传稳定性。

第四代基因工程：全基因组的克隆与编辑 基因组工程 第四代基因工程：全基因组的克隆与编辑 基因组工程 将化学合成的 蕈状支原体基 因组克隆在酵 母中，经甲基 化修饰后移植 到山羊支原体 受体细胞中。 由此生成了一个基因组最小化的蕈状支原体化学合成型活性细胞JCVI-syn3.0，仅含473个基因，但生长速度降低两倍。 J.C.Venter et al. Science 351, 1414, 2016

第四代基因工程：基因组工程 全基因组定点编辑 第四代基因工程：基因组工程 全基因组定点编辑 基因组工程的另一项最新进展是利用CRISPR-Cas9系统在哺乳动物活细胞内对基因组上的各基因进行定向敲除，并由此建立起基因与表型之间的因果关联。在该系统中，细菌来源的核酸内切酶Cas9能在短小单链RNA（sgRNA）的指导下，序列特异性地定位并作用于复杂基因组上，从而实现对哺乳动物大型基因组各区域的功能查询。T. Wang et al. Science 343, 80, 2014；O. Shalem et al. Science 343, 84, 2014

1 重组DNA技术与基因工程的基本概念 D 基因工程的基本原理 提高外源基因的剂量：分子遗传学原理 筛选修饰重组基因表达的转录调控元件：分子生物学原理 如：启动子、增强子、操作子、终止子、上游调控序列等 修饰构建蛋白质生物合成的翻译调控元件：分子生物学原理 如：SD序列、mRNA非编码区、密码子、polyA位点等 工程菌（微型生物反应器）的增殖及稳定生产：生化工程学原理

1 重组DNA技术与基因工程的基本概念 E 重组DNA与基因工程的支撑技术 核酸凝胶电泳技术 核酸分子杂交技术 细菌转化转染技术 寡核苷酸合成技术 基因定点突变技术 聚合酶链反应技术

1 重组DNA技术与基因工程的基本概念 A 重组DNA技术与基因工程的概念辨析 B 重组DNA技术与基因工程的基本用途 C 基因工程的基本形式 D 基因工程的基本原理 E 重组DNA与基因工程的支撑技术