读书报告 汇报人：赵卓丽 2016-5-21

Kutch（喀奇县）:印度西部古吉拉特邦辖县 Japan EXTREMOPHILES IF=2.306 极端微生物 世界上最大的盐碱沙漠中的微生物群落的分类学多样性分析 Kutch（喀奇县）:印度西部古吉拉特邦辖县 宏基因组学

Contents 1 2 3 4 5 Abstract Introduction Materials and methods Results Discussion 5

Abstract 盐碱沙漠 不同盐度 (4.11-30.79%) 宏基因组学 七个样本 不同季节 动态变化 多样性丰富 67个古细菌属 覆盖了已知所有古菌属的60% 微生物群落 高度正相关 Salinbacter 盐度 拟杆菌门 鞘脂杆菌纲 鞘脂杆菌目 泉发菌科 组成与咸水湖的海洋生物群落 更为相似

盐湖、苏打水湖泊、咸水泉、盐沼泽、太阳能盐田 Introduction 盐湖、苏打水湖泊、咸水泉、盐沼泽、太阳能盐田 极端自然环境-高盐度生态系统 高盐度区域 Kutch 水生微生物 土壤和沉积物中的 微生物 海洋和陆地生态系统的过渡区 占地7505平方公里、干燥、表面覆盖黑色沙土。经历极端气候条件（夏季平均气温约44 ℃至50℃、冬季最低温度接近或低于零度）和高盐度环境使其具有独特的微生物群落多样性。

弥补用生物地球化学和细菌培养式的方法的局限性 Introduction Metagenomics 宏基因组测序 研究对象 特定生境中的微生物群落 研究方法 采用新一代高通量测序技术，获得环境微生物基因信息总和 环境微生物的群落结构、物种分类、系统进化、基因功能及代谢网络 研究目的 综合性分析微生物在极端环境或特殊生态系统中的生存和适应机制 弥补用生物地球化学和细菌培养式的方法的局限性

Materials and methods 1 2 3 4 5 生境描述、采样 样品物理化学分析 DNA 提取、测序 实时荧光定量PCR 生物信息学、统计分析 5

每个样点5-10个样本随后混合用于宏基因组测序 Materials and methods 1、生境：年平均温度45℃，年平均降水量147mm，海侵形成。 2、在内陆沙漠，盐度跨度大，无人破坏处采样。 S1 (23° 48′ 39″ N, 70° 58′ 60″ E) S2 (23° 47′ 33″ N, 71° 0′ 29″ E) S3 (23° 54′29″ N, 70° 32′ 16″ E) S5 (23° 50′ 6″ N, 69° 31′ 8″ E) S6 (23° 56′ 27″ N, 70° 11′ 18″ E) S4 (23° 56′ 29″ N, 70° 11′ 18″ E) S7 (23° 56′ 26″ N, 70° 11′ 16″ E 取自沙漠150km横断面的各个盐度处 2012.10 2013.4（最热月份） 2013.7（最潮湿月份） 每个样点5-10个样本随后混合用于宏基因组测序

Fig. 1 Map showing Great Rann of Kutch, Gujarat, INDIA and Images of sample collection sites (S1, S2, S3, S4, S5, S6,S7). a Map of Gujarat showing Great Rann of Kutch in the inset of India.b Geographical location of sample collection sites of Great Rann of Kutch.

Results 1. 样品物理化学性质 PH:7.18-8.6 微碱性 总有机碳：1.1-1.6% 导电率：68.5MS/cm-513.3MS/cm 7倍以上的盐度差别 总有机氮：0.09-0.48%

Results 2.宏基因组分析和微生物多样性 235993491–387783372 bp 序列 M5nr IMG/M NCBI 数据库 细菌：56-87% 古菌：8-40% 病毒：0.02-1% 真核生物：0.1-2% 不可读取序列：9-14%  主要原核生物： 变形菌门（18.6-47.7 %）、广古菌门 (7.9-40.1 %)、拟杆菌门 (9.1-18.7 %)、厚壁菌门 (5.8-8.4 %)、 放线菌门 (2.1-5.8 %)、 蓝藻细菌（2-4.2%）。  含量较少的门： 绿弯菌门（1-5.3%）、异常球菌-栖热菌门（0.5-1.4%）、浮霉菌门 （1.3-3.9%）、芽单胞菌门（1-1.9%）。

Results 2. 微生物多样性 – 细菌 变形菌门 相对丰度 门水平： α-变形菌（5.7-19.4%）、γ-变形菌（5.4-17.6%）、δ-变形菌（5.4-11.6%） β-变形菌（1.7-5.1%）、ε-变形菌（0.2-0.5%）、ζ-变形菌 属水平： α-变形菌（135个）、γ-变形菌（167个）、δ-变形菌（60个）、 β-变形菌（75个） 海杆菌属、地杆菌属、硫杆菌属、伯克氏菌属

Results 2. 微生物多样性 – 细菌 拟杆菌门（68个属） 厚壁菌门（146个属） Salinibacter (0.7–13.8 %) Rhodothermus(0.7–1.7 %) 芽孢杆菌属 (0.8–1.2 %) 放线菌门 广泛存在于土壤和淡水和盐度较低的生境中 93个属 红色杆菌属（0.2-0.7%） 丰度最高 高盐度生境 蓝藻细菌（优势种为聚球藻属）、绿弯菌门、浮霉菌门

Results 2. 微生物多样性 – 古菌 古菌（8-40%） 广古菌门（67个属） 产甲烷古菌、嗜盐古菌、嗜热古菌 4-11% 存在于炎热的高盐度生境

Results 3.随含盐量梯度变化的分类变化 Fig. 2 Taxonomic distribution of bacterial and archaeal phyla of saline desert of Kutch. Relative abundance of reads assigned to bacterial and archaeal phyla in the 7 metagenomes using M5nr database. Results 3.随含盐量梯度变化的分类变化 细菌丰度 R=-0.77 古菌对盐度的耐受力 大于细菌 含盐量梯度 古菌丰度 R=-0.60

Results 3.随含盐量梯度变化的分类变化 Fig. 2 Taxonomic distribution of bacterial and archaeal phyla of saline desert of Kutch. Relative abundance of reads assigned to bacterial and archaeal phyla in the 7 metagenomes using M5nr database. Results 3.随含盐量梯度变化的分类变化 Proteobacteria R=-0.69 含盐量梯度 负相关性 Verrucomicrobia R=-0.70

蓝藻细菌随着盐度从低到高，微生物群落有种群衰落的迹象。 Results 3. 随含盐量梯度变化的分类变化 含盐量梯度 非线性 放线菌门、绿弯菌门、螺旋体门 反向的U型弯曲 在低盐度和高盐度时丰度低 变形菌门 含盐量最高的样品S3 α-变形菌百分比含量最高 β-变形菌百分比含量最低 含盐量较低的样品S2 结果相逆 蓝藻细菌随着盐度从低到高，微生物群落有种群衰落的迹象。 R=0.85 含盐量梯度 Salinibacter

Results 3. 随含盐量梯度变化的分类变化 高盐度 S3 S5 富含广古菌门（盐盒菌属、盐方菌属、盐几何菌属、富盐菌属、嗜盐碱单孢菌属） S6 优势菌属：Salinibacter 属 中盐度

Results 3.随含盐量梯度变化的分类变化 低盐度 S1 S2 细菌丰度＞古菌丰度 产色素微生物、硫酸还原微生物丰度较高。

从门水平、属水平观察到群落明显的季节性变化 Results 4. 微生物群落的季节性变化 S6 10月（2012-10-31）：最高盐度样本 S4 4月（2013-4-28）：最热。平均气温41℃、最高达到49.5℃ S7 7月（2013-7-27）：最潮湿。月平均降水量147mm 4月 10月 7月 细菌：古菌 1.8:1 4:1 广古菌门 33.7% 34.4% 19.5% 拟杆菌门 11.3% 18% 9.11% 产甲烷古菌 7月相比4月增长了1.6倍 不产甲烷古菌 7月相比4月下降了1.2倍 从门水平、属水平观察到群落明显的季节性变化 优势种群维持不变

Results 5. 多样性评估 稀疏曲线法 Fig. 3 Rarefaction analysis for the observed species. The rarefaction curves for samples S3, S4, S5, S6 and S7 reached the near-plateau phase representing good sampling depth; however, S1 and S2 did not reach a clear asymptote

Results 5. 多样性评估 香农指数 S3：细菌多样性最低 S2：古菌多样性最低 S5：细菌、古菌多样性最高 均匀性分析 非参数丰富度估计 季节性变化 古菌：S6最高 S2最高

Results 6. 功能基因与代谢 核心代谢功能 主要功能基因分类 蛋白质代谢 （9.5-10.9%） 碳水化合物代谢 （6.4-10.2%） 氨基酸及其衍生物代谢 （5.0-8.8%） 维生素和色素代谢 （3.9-6.8%） 外源性物质的降解与代谢 （4.3%）

氧化应激（45.1-58.4%）、渗透压应激（15.4-20.5%）、热休克应激（12.4-28.2%） Results 6. 功能基因与代谢 适应复杂的生境所采取的生存策略 应激响应基因占所有功能基因的2.1-4.1% 氧化应激（45.1-58.4%）、渗透压应激（15.4-20.5%）、热休克应激（12.4-28.2%） Fig. 5 Relative abundance of stress response gene categories. Relative abundances of genes related to stress response in SEED subsystem obtained from five location-based samples (S1, S2, S3, S5 and S6). Bar graph represents percentage of abundance

Results 6. 功能基因与代谢 低盐度、中盐度样品 （S1、S2、S6）：氧化应激基因高表达

Results 7.与其他微生物群落组成进行比较 咸水湖 海洋 河口 海岸 Fig. 6 PCoA plot of the relative abundance of taxonomic (Phylum) profiles of the selected biomes. Principal coordinate analysis using Bray-Curtis distance of the selected biomes. Comparative sites include hot desert H1, H2 (Chihuahuan desert, New Mexico), H3 (Mojave desert, california); sea O1 (Puget Sound estuary) O2 (ElbaSant Andrea coast) O3 (Sargasso sea); saturated brine B1, B2 (Spain); solar saltern A1, A2 (Chula vista, CA); hypersaline lagoon L1, L2 (Marmenor, murcia) datasets. S1, S2, S4, S6 and S7 cluster with O1, O2 and O3 whereas S3 and S5 cluster with hypersaline lagoon L1, L2 metagenomes 咸水湖 海洋 河口 海岸

Results 7.与其他微生物群落组成进行比较 嗜盐细菌多 相似度高： α-变形菌 β-变形菌 Γ-变形菌 产甲烷菌 嗜盐细菌 Fig. 7 Stacked bar representing distribution of various classes in saline desert and other saline and desert biomes. Stacked bar showing taxonomic distribution for all retrieved sequences 相似度高： α-变形菌 β-变形菌 Γ-变形菌 产甲烷菌 嗜盐细菌

Results 8.与其他微生物群落功能进行比较 咸水湖、太阳能盐田的生物群落 海洋生物群落 Fig. 8 PCoA plot of functional SEED Subsystem level 1 of the selected biomes. Functional community composition of the saline desert metagenomes (S1, S2, S3, S4, S5, S6, S7) and other saline, hypersaline and desert environments, based on principal coordi- nate analysis of the relative abundances of all MG-RAST subsys- tems. Principal coordinate analysis using Bray-Curtis distance of the selected biomes. Comparative sites include hot desert H1, H2 (Chihuahuan desert, New Mexico), H3 (Mojave desert, california); sea O1 (Puget Sound estuary) O2 (Elba Sant Andrea coast) O3 (Sargasso sea); saturated brine B1, B2 (Spain); solar saltern A1, A2 (Chula vista, CA); hypersaline lagoon L1, L2 (Marmenor, murcia) datasets. Func- tional diversity patterns amongst biomes shows S1, S2, S4, S6 and S7 cluster with O1 and O2 whereas S3 and S5 cluster with O2, L1 and L2 咸水湖、太阳能盐田的生物群落 海洋生物群落

Results 9.qPCR量化细菌和古菌 细菌＞古菌 低盐度样本 高盐度样本 季节性影响（S4、S6、S7）：古菌负荷较高

Discussion 季节性盐沼和世界上最大的盐沙漠-喀奇县沙漠 高温、降水、高盐度 宏基因组学 未知微生物群落在极端环境中的生存与适应机制，功能属性 高盐土壤、沉积物：变形菌门、拟杆菌门、厚壁菌门 优势种群 本文研究盐碱沙漠显示了广古菌门的优势地位

盐盒菌属、盐方菌属、盐几何菌属、富盐菌属、嗜盐碱单孢菌属 Discussion 高盐度主导 Salinibacter 低盐度主导 Marinobacter, Rhodothermus and Rhodobacter 盐盒菌属、盐方菌属、盐几何菌属、富盐菌属、嗜盐碱单孢菌属 盐度是关键影响因素 Salinibacter 关键的环境影响因子

在极端环境下，生物的核心基因对 维持细胞的生存与繁殖 进行了唯一响应 Discussion qPCR列举分析 验证复杂的微生物组成中的微生物负荷 捕捉季节性变化时细菌和古菌的数量上的变化 大量的碳水化合物代谢基因和DNA代谢基因 功能水平 在极端环境下，生物的核心基因对 维持细胞的生存与繁殖 进行了唯一响应 大量的氨基酸代谢基因表达 用于维持机体渗透压的基于氨基酸的一些溶质

低盐度的氧化应激反应大于高盐度可能是相关微生物在更广泛领域的一个可利用性。 Discussion 高水平的丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸表达 功能水平 维持连续酸性氨基酸的生物合成 维护一个阳离子环境高系统 外源性物质生物质降解基因的存在 嗜盐菌可能被用来降低外源性物质的生物质化合物 多样性变化 氧化应激和渗透压力应激 低盐度的氧化应激反应大于高盐度可能是相关微生物在更广泛领域的一个可利用性。

对潮湿季节时沙漠转换为一个浅的含盐湿地环境的适应 Discussion 季节性变化 7月：绿弯菌门、蓝藻细菌、浮霉菌门 气候：干燥、极热 4、10月：广古菌门 对潮湿季节时沙漠转换为一个浅的含盐湿地环境的适应 物种进化

Discussion 海洋生态系统 陆地生态系统 盐碱沙漠 微生物生态学、分类学及其功能属性

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