实验2: 免疫沉淀技术 华西医院实验医学科临床免疫实验室 安云飞 2018.03.14

背景 絮状沉淀试验 液体内沉淀试验 免疫浊度测定 沉淀反应 单向扩散试验 凝胶内沉淀试验 双向扩散试验 抗原-抗体反应 直接凝集反应 间接凝集反应 间接血凝试验 胶乳凝集试验 明胶凝集试验 液体内沉淀试验 凝胶内沉淀试验 单向扩散试验 双向扩散试验 絮状沉淀试验 免疫浊度测定

免疫扩散技术——IgG测定

单向免疫扩散试验 （single immunodiffusion test） 抗原——可溶性抗原 抗体——相应抗体 介质——凝胶 现象——肉眼可见的沉淀环 作用——定量 methods from clinical chemistry\standard cruve.JPG

实验原理 单向免疫扩散试验 将一定量抗体混匀于琼脂糖凝胶内。制板，打孔，在凝胶孔中加入标准抗原溶液或待测样本。 可溶性抗原在凝胶中向四周呈辐射状扩散并与凝胶中的抗体发生特异性结合，在抗原抗体比例合适处形成白色沉淀环。 沉淀环的大小与抗原的浓度成正相关。以不同浓度标准抗原液制做标准曲线，通过待测标本沉淀环大小（直径）可在标准曲线上查出其抗原浓度。

试剂与器材 羊抗人IgG抗体（单扩效价1:10） 待测血清 琼脂糖 生理盐水 温度计、玻璃板、打孔器、加样器、刻度尺等

操作流程 1 琼脂糖凝胶准备 2 倒板、打孔 3 加样 4 扩散 5 结果判读

1 琼脂凝胶准备 用生理盐水配制浓度为1.2%（12g/L）的琼脂糖凝胶，置于水浴中煮沸溶化至澄清。 （已完成）

2 倒 板 将U型片置于两块玻璃板之间并以铁夹固定，直立于水平台面待用。 取9mL已溶化的琼脂糖凝胶于试管中 2 倒 板 将U型片置于两块玻璃板之间并以铁夹固定，直立于水平台面待用。 取9mL已溶化的琼脂糖凝胶于试管中 待琼脂糖温度降至56℃时，加入羊抗人IgG诊断血清1mL，在两支试管间颠倒混匀后迅速倒入事先固定好的玻璃板的间隙中。 待凝胶板完全冷却后，先取下铁夹再小心取下上面的玻璃板和U型片。（已完成）

3 打 孔 使用打孔器在凝胶板上打孔： 孔径：约3.5mm 孔距：10-12mm 7孔（2排）第一排：S1，S2，S3， 3 打 孔 使用打孔器在凝胶板上打孔： 孔径：约3.5mm 孔距：10-12mm 7孔（2排）第一排：S1，S2，S3， 第二排：S4, S5，样本（重复2孔） 10-12mm S1 S2 S3 3.5mm S4 S5 1 2

4 加 样 系列标准品稀释：用生理盐水将IgG标准品（S1）按1:2、1:4、1:8、1:16稀释成为系列标准品S2-S5。 4 加 样 系列标准品稀释：用生理盐水将IgG标准品（S1）按1:2、1:4、1:8、1:16稀释成为系列标准品S2-S5。 待测样本用生理盐水1:2稀释。 每孔10μL，将标准品（S1-S5）或稀释后样本加入孔中。 注意：做好标记

5 扩 散 将加样完毕的凝胶板放入湿盒。 37 ℃，扩散24小时。

6 结果判读 准确测量S1-S5沉淀环的直径（单位：mm） 以沉淀环直径与相应标准品浓度的对数值绘制标准曲线。 准确测量待测样品的沉淀环的直径，在标准曲线上查出待测样本中IgG的浓度。

标准曲线（standard curve）： 指通过测定一系列已知组分的标准物质的某理化性质，而得到的性质的数值曲线。是标准物质的物理/化学属性跟仪器响应之间的数学关系。 横坐标(X)表示可以精确测量的变量（如标准溶液的浓度），称为普通变量； 纵坐标(Y)表示仪器的响应值（测量值），如吸光度、电极电位等，称为随机变量。

如何绘制标准曲线？ 横坐标——各稀释度标准液的沉淀环直径 纵坐标——相应孔IgG浓度的对数值( log IgG ) 注意： IgG浓度的单位： g/L 沉淀环直径的单位：mm

注意事项 倒板： 1. 严格控制加入诊断血清时的温度：56 ℃ 温度过高：抗体的免疫活性受损，失去与相应抗原特异性结合的能力； 温度过低：凝胶开始凝结，抗体不能均匀分布于凝胶，并且倒板也不能平整均匀。 2. 注意防止凝胶与下层玻璃板分离。 取上层玻璃板时，应用手固定U型片并推动上层玻璃板，然后取下上层玻璃板。

注意事项 打孔： 1. 孔的边缘光滑圆整，不要破裂。 2. 孔径不宜过大（约3.5mm），孔间距及孔中心与凝胶板边缘的距离至少应有10-12mm。

注意事项 扩散： 在湿盒中进行。 扩散时琼脂板应保持水平，以免沉淀环变形，影响结果判定。

注意事项 测量： 测量沉淀环直径必须准确，否则明显影响结果。 当沉淀环不是正圆形时，应量取最大直径和最小直径后取二者的平均值带入计算。 每批实验均应同步绘制标准曲线。 样品最好做复孔，取直径的平均值带入计算。

方法评价 该方法不需要特殊设备，一般实验室即可开展此试验；其结果经染色、干燥后可长期保存。 但是，该方法操作繁琐，灵敏度低（1.25mg/L），观察结果时间长，每次测定需同时做标准曲线。

思 考 ？ 1、单扩试验的影响因素有哪些？ 2、单扩试验与胶乳凝集试验和免疫比浊法相比有何异同？ 3、单扩试验的意义？

单 扩 试剂质量 操作规范 标准曲线 温度 异常结果解释 其他…… （抗血清，标准抗原，凝胶） （制胶、倒板、 打孔、加样） （稀释、测量、绘图） 异常结果解释 单 扩

单扩 改进方法 自由扩散 加入外力？ 凝胶介质 其他介质？

凝胶内沉淀反应：抗原依靠物理性质在凝胶介质中自由扩散。 免疫电泳技术：电泳分析+沉淀反应（电场） 优点：加速沉淀反应速度； 电场规定了抗原和（或）抗体的扩散方向； 区分蛋白质组分。 1.对流免疫电泳：电泳+双扩 2.火箭免疫电泳：电泳+单扩 3.免疫电泳： 区带电泳+双扩 4.免疫固定电泳：区带电泳+沉淀反应

液体内沉淀反应：免疫比浊测定 优点：自动化程度高； 快速、灵敏、稳定、精密； 抗原过量检测 1.透射免疫比浊法： 2.散射免疫比浊法：终点法；速率法 3.免疫胶乳比浊法： BECKMAN COULTER IMMAGE800 临床实验方法介绍

单扩试验的应用 定量试验，用于检测人体内小分子物质含量：IgG、 IgA、 IgM，C3、C4，特种蛋白等。 灵敏度低（1.25mg/L），时间长（24h）重复性差，目前基本被淘汰。 临床在用仪器多为：速率散射比浊法。 灵敏度高（ug/L），快速（几分钟），精密度 高（CV<5%），准确（抗原过量检测）

临床意义 免疫球蛋白（Immunoglobulin, Ig）是由浆细胞合成和分泌的一组具有抗体活性的球蛋白，存在于人体的血液、体液、外分泌液及某些细胞（如淋巴细胞）膜上。 按重链：IgG、IgA、IgM、IgD、IgE 按轻链：κ 型、λ型 检测意义：反应机体的免疫功能； 诊断疾病； 评价疗效

Ig的含量 血清中： 体液中： IgG、 IgA、 IgM—— g/L IgD、 IgE—— mg/L IgG、 IgA、 IgM——mg/L Ig种类 血清含量（g/L） IgG 7—16 IgA 0.7—4.0 IgM 0.4—2.3 IgD 0.003-0.030 IgE

临床意义 低Ig血症： 高Ig血症： 先天性：原发性免疫缺陷病（PID） 获得性：免疫抑制剂；淋巴系统恶性肿瘤；肾病 综合征；剥脱性皮炎 肝病 单克隆Ig增高：多发性骨髓瘤；巨球蛋白血症； 重链病；轻链病

Ig的生物学活性 IgG：抗菌、抗病毒、抗毒素，自身抗体 IgA：粘膜局部免疫，抗菌、抗毒素 IgM：参与早期感染防御，溶菌，溶血， 类风湿因子 IgD：膜结合型（mIgD构成BCR），是B细 胞分化发育成熟的标志 IgE：变态反应性疾病，寄生虫感染

IgG分为4个亚型：IgG1，IgG2，IgG3， IgG4 每个亚型有各自的特性和功能，亚型检测与疾病的相关性（新生儿溶血、膜性肾病、原发性小血管炎等）

实验报告的要求 内容完整：实验题目、实验原理、试剂及器材、实验步骤、实验结果（注明样本编号和原始数据）、思考讨论等。 实验报告由班长收齐后于下次上课时交。