Zoonbio Biotechnology NANJING ZOONBIO BIOTECHNOLOGY Co., Ltd. 植物内源激素检测概述 NanJing Zoonbio Biotechnology ZOONBIO BIOTECH Zoonbio Zoonbio Zoonbio Biotechnology

综述 各类植物激素简介

一、综述 植物内源激素是植物自身合成的，痕量而对植物的生长发育起着至关重要的作用的小分子物质。 （You et al.,2015） 1、内源激素含量与种子成熟密切相关 2、内源激素在植物不同部位、不同时期含量差异很大

（Sun et al.,2011） （He et al.,2013） 植物内源激素对植物生长的调控是一个非常复杂的过程。

1、植物内源激素的时空差异性是一个非常复杂的问题 其中并非没有规律可循 （Kojima et al.,2009）

生长素类 生长素(auxin)可调控顶端优势、细胞延伸、维管束分化、脱落抑制、气孔发育和其它过程。它的含量及在器官中的分布决定了植物器官的形态建成、株型以及向重性反应等生物学进程。 植物生长状态改变 植物生理生化反应 基因表达 反馈调节 生长素 生长素-受体复合物 IAA IBA 生长素受体 ABP1 信号转导与调控

吲哚乙酸广泛存在于各植物组织中。由于其在茎尖、芽尖、胚芽鞘、发育中的种子等部位生成，并转运至其它组织中，因此通常这些部位中含量较高。 吲哚丁酸在我们一般检测过植物组织中含量较低。但在苹果组织中含量极高。

脱落酸 脱落酸一般被认为是一种抑制植物生长及促进衰老的物质。近年来的研究表明，它在植物胚胎发育、种子休眠、气孔运动、果实成熟、逆境响应、根系生长发挥重要作用。 甲羟戊酸 法尼基焦磷酸 环化、氧化 玉米黄质 黄质醛(Xan) ABA (间接合成) (直接合成)

在组织中普遍存在，未萌发的种子中含量较高。 ABA信号转导模式图（Liang et al.,2013）

赤霉素类 赤霉素是一种二萜类物质，迄今共发现100余种，但只有少数几种存在生物学活性。赤霉素调控了植物生命过程中的许多阶段，包括种子发芽、茎叶生长、开花、延缓果实成熟等等。 甲羟戊酸 牻牛儿牻牛儿焦磷酸 内根-贝壳杉烯 GA1 GA3 GA12-7-醛 GA15 GA5 GA4 GA20 GA3 GA1 GA7 GA4

正调控：IAA（Wolbang et al.,2004）、BR（Bouquin et al.,2001）。 负调控：ABA（Zentella R et al.,2002）、CTKs （Greenboim et al.,2005）、自身反馈调节。 GAs信号转导模式图

赤霉素3（GA3）、赤霉素4（GA4）： 存在于植物生长旺盛的部位，如幼叶、根尖、果实、发育中的种子中。 未开始萌发的种子中含量很低（如灌浆期的水稻籽粒），因为此时的赤霉素处于结合状态。

细胞分裂素类 在植物中，细胞分裂素可诱导细胞的分裂与增值，而且在诱导芽的分化、叶绿体发育、养分运输、植物抗衰老等方面都扮演了重要角色。 zeatin TZR IP IPA 结合态 游离态

主要存在于快速生长、分裂的器官中，如根尖、芽尖、幼叶、未成熟的果实、种子中。 而在已经成熟的器官中含量很低，如成熟植株的叶、茎、种子等。

油菜素内酯 油菜素内酯是公认的活性最高的高效、广谱、无毒的植物生长激素。BR能充分激发植物内在潜能，促进作物生长和增加作物产量，提高作物耐冷性，改善作物抗病、抗盐能力，使作物的耐逆性增强等 。 可以促进穗粒增加而不改变株型

生理浓度下促进GAs的合成 高浓度下抑制GAs的合成

茉莉酸类 茉莉酸及茉莉酸甲酯具有相当广谱的生理活性，影响包括种子萌发、果实成熟衰老、根生长、花粉发育、胁迫响应等等。 JA MeJA

研究发现茉莉酸是胁迫下响应最快的小分子物质，在抗逆方面的作用与ABA相近，在植物体内含量与ABA成正相关（Ellis et al 而茉莉酸的响应途径与水杨酸存在交差，它们的作用是相互拮抗的（Petersen et al.,2000）。 而和乙烯在不同胁迫下即存在协同也存在拮抗作用（lorenzo et al.,2005）。 茉莉酸信号转导途径

水杨酸 激活植物过敏反应及系统获得行抗性的信号分子。主要调控包括抗病、抗盐、抗旱等。此外也有延缓果实成熟衰老，促进茎叶生长等特性。 在各类物种及部位中广泛存在，水稻中含量极高。 水杨酸、茉莉酸信号转导途径

独脚金内酯 独脚金内酯是近年来新发现的植物生长调节物质。它在植物根部合成，除了参与调节植物根系生长外，也向上运输至茎，影响植物侧枝生成。 5-DS

实验原理 物质提取： 植物内源激素是植物自身合成的、对植物生长发育起重要调控作用的物质。由于其本身含量较低，而又参与调控了植物的整个生长过程，因此准确检测植物激素在植物内的浓度变化以及组织特异性分布，是了解其代谢途径和运输过程的重要前提。 植物内源激素检测中的难点包括：1、激素在植物体内含量低；2、激素类物质对光、温度等环境因素较敏感；3、植物组织基质比较复杂。为提取常规酸碱性激素，本实验采用异丙醇/水/盐酸溶液的方法，通过提取液加酸提高激素在有机溶剂中溶解性并钝化组织中的部分酶。而后通过二氯甲烷萃取并以氮气吹扫方式浓缩样品，该方法流程相对简单，待测物损失较小，同时由于Qtrap6500仪器的灵敏性，不需过多繁琐的净化步骤即可准确检测大部分痕量待测物。

液质检测： 本实验使用AB公司Qtrap6500质谱仪，此质谱仪的质量分析器为三重四级杆-离子肼模式。采用ESI-HPLC-MS/MS方法对植物激素进行定量分析。以安捷伦1290高效液相色谱仪分离样品物质，以电喷雾电离(ESI)为离子源，经多通道检测（MRM）模式扫描。即同时进行多个SIM（选择离子监测）模式扫描。该模式常用于对目标化合物检测，灵敏度高，但缺乏进一步的物质结构信息。其原理是质量分析器（Q1）特异性选择母离子（parent ion）后，在碰撞反应室（Q2）将母离子通过碰撞诱导解离（collision-induceddissociation, CID）使这一离子裂解生成子离子（daughter ions），在Q3选择子离子，并对其信号进行检测。对于大多数激素我们都会检测2个或3个子离子，并取其中一个（通常为响应值较高的）作为定量离子。其余子离子作为定性离子。以目标物质在样品及标准品中的出峰时间，以及目标物质各子离子之前的比值在样品及标准品中的比值确定样品中的待测物。并通过标准曲线法对待测物定量。

实验步骤 激素提取： （1）.准确称量约1 g新鲜植物样品，于液氮中研磨至粉碎； （2）.向粉末中加入10 ml异丙醇／盐酸提取缓冲液，4 ℃震荡30 min； （3）.加入20 ml二氯甲烷，4 ℃震荡30 min； （4）.4 ℃，13000 rpm离心5 min，取下层有机相； （5）.避光，以氮气吹干有机相，以400 µl甲醇（0.1%甲酸）溶解； （6）.过0.22 µm滤膜，进HPLC-MS/MS检测。

液相条件 色谱柱：poroshell 120 SB-C18反相色谱柱（2.1×150,2.7 um）； 柱温：30 ℃； 流动相：A:B=（甲醇/0.1%甲酸）:（水/0.1%甲酸）； 洗脱梯度：0-2 min，A=20 %；2-14 min，A递增至80 %；14-15 min，A=80 %；15.1 min，A递减至20 %；15.1-20 min, A=20 % 进样体积：2 µl。

质谱条件： 气帘气：15 psi 喷雾电压： 4500 v 雾化气压力：65 psi 辅助气压力：70 psi 雾化温度： 400 ℃ 物质名称 极性 母离子（m/z） 子离子（m/z） 解簇电压(V) 碰撞能量（V） IBA - 202 116/158/184 -80 -20/-18/-19 GA3 345.2 143.0/239.2 -30/-33 JA 209.2 58.9/165.2 -54 -16/18 MeJA 225.1 151.1/193.1/133 -50 -16/-10/-18 SA 137 92.9/65 -20/-39 ABA 263.1 153.0/204.2 -60 -14/-27 GA4 331.4 243.2/213.1 -131 -24/-39 Z + 220.4 136/202.1 92 22/16 ZR 352.3 220.2/136/202.1 90 25/40/32 IAA 176.2 129.8/102.9 65 12/42

实验案例 标准曲线

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