Genetic Recombination and Genetic Engineering 第14章　基因重组与基因工程 Genetic Recombination and Genetic Engineering 主讲教师：王玉

14.1 自然界DNA重组和基因转移 14.1.1 同源重组是最基本的DNA重组方式 同源重组 (homologous recombination) 位点特异的重组(site-specific recombination) 转座重组 (transpositional recombination)

14.1.2　细菌的基因转移与重组有四种方式 接合作用 (conjugation) 转化作用 (transformation) 转导作用 (transduction) 细胞融合(Cell fusion)

14.2 重组DNA技术 又称DNA克隆或分子克隆 1865年 G.J.Mendel的豌豆杂交试验。 1944年 O.T.Avery的肺炎球菌转化实验。 1973年 美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组DNA分子。 1977年 美国南旧金山建立世界上第一家遗传工程公司，专门应用重组DNA技术制造医学上重要的药物。 1980年 开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂。 1997年 英国罗林研究所成功的克隆了多莉。 重组DNA技术的发展史

14.2.1 重组DNA技术相关概念 （一） DNA克隆 克隆(clone):来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。 DNA克隆（DNA cloning）： 应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子——复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，也称基因克隆（gene cloning）或重组DNA (recombinant DNA) 。

基因工程(genetic engineering) —— 实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，又称重组DNA技术(recombinant DNA technology) 。 目的： ① 分离获得某一感兴趣的基因或DNA ② 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）

（二）工具酶 限制性核酸内切酶 DNA聚合酶Ⅰ 逆转录酶 T4DNA连接酶 碱性磷酸酶 末端转移酶 Taq DNA聚合酶

+ 限制性核酸内切酶（restriction endonuclease，RE） 定义： 限制性核酸内切酶是识别DNA的特异序列, 并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。 Bam HⅠ GGATCC CCTAGG G CCTAG + GATCC G

分类： Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技术中常用Ⅱ型） 作用： 与甲基化酶（methylase）共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA，保护自身DNA。

Hin dⅢ 命名： Haemophilus influenzae d株 流感嗜血杆菌d株的第三种酶 属 系 株 序 属 系 株 序 第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。

Ⅱ类酶识别序列特点—— 回文结构(palindrome) GGATCC CCTAGG 切口 ：平端切口、粘端切口

+ + 平端切口 粘端切口 GTCGAC CAGCTG GGATCC CCTAGG GTC CAG GAC CTG GATCC G G HindⅡ Bam HⅠ GTCGAC CAGCTG GGATCC CCTAGG GTC CAG GAC CTG GATCC G + + G CCTAG 左下角处有超级链接到配伍末端 平端切口 粘端切口

（三）目的基因(target gene) 感兴趣的基因或DNA序列即目的基因 cDNA (complementary DNA) 指经反转录合成的、与RNA (通常指mRNA或病毒RNA)互补的单链DNA。以单链cDNA为模板、经聚合反应可合成双链cDNA。 基因组DNA (genomic DNA) 指代表一个细胞或生物体整套遗传信息(染色体及线粒体)的所有DNA序列。

（四）基因载体 定义 为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。 常用载体 质粒DNA 噬菌体DNA 病毒DNA

克隆载体(cloning vector) 为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。 表达载体(expression vector) 为使插入的外源DNA序列可转录翻译成 多肽链而特意设计的载体称为表达载体。

载体的选择标准： 能自主复制； 具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定； 有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点； 分子量小，以容纳较大的外源DNA。

质粒 (plasmid) 特点: 能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息, 会赋予宿主细胞一些遗传性状。

14.2.2　重组DNA技术基本原理及操作步骤 基本过程 目的基因的获取 重组DNA导入受体细胞 外源基因与载体的连接 克隆载体的选择和构建 重组体的筛选 克隆基因的表达

以 质 粒 为 载 体 的 DNA 克 隆 过 程 分 切 接 转 筛 表

（一）目的基因的获取 化学合成法 基因组DNA文库(genomic DNA library) cDNA文库(cDNA library) 聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)

（二）克隆载体的选择和构建 目的不同，操作基因的性质不同，载体的选择和改建方法也不同。

（三）外源基因与载体的连接：DNA连接酶催化 粘性末端连接 方式：(1)同一限制酶切位点连接 (2)不同限制酶切位点连接 配伍末端连接

2．平端连接： 适用于限制性内切酶切割产生的平端和粘端补齐或切平形成的平端。 3．同聚物加尾连接： 由末端转移酶加同聚物序列再粘端连接。 4．人工接头连接： 由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。

（四）重组DNA导入受体菌 受体菌条件 安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷 处于感受态（competent） 导入方式 转化 （transformation） 转染 （transfection） 感染 （infection）

（五）重组体的筛选 1．直接选择法 (1) 抗药性标记选择 (2) 标志补救(marker rescue) (3) 分子杂交法 原位杂交 Southern印迹 2．免疫学方法 如免疫化学方法及酶免检测分析等

α互补 利用α互补原理筛选重组体pUC18

（六）克隆基因的表达 表达体系的建立： 表达载体的构建 受体细胞的建立 表达产物的分离纯化

重组DNA技术操作过程可形象归纳为： 分 获取目的基因和载体 切 限制酶切目的基因与载体 接 拼接重组体 转 转入受体细胞 筛 筛选重组体 表 表达蛋白质