实 验 生 物 学 重组DNA技术与基因工程 华东理工大学 张惠展.

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实 验 生 物 学 重组DNA技术与基因工程 华东理工大学 张惠展

重组DNA技术与基因工程 1 重组DNA技术与基因工程的基本概念 2 重组DNA技术所需的基本条件 3 重组DNA技术的操作过程 4 目的基因的克隆与基因文库的构建 5 外源基因在大肠杆菌中的表达 6 外源基因在酵母中的表达

1 重组DNA技术与基因工程的基本概念 A 重组DNA技术与基因工程概念辨析 重组DNA技术的定义 重组DNA技术是指将一种生物体(供体)的基因与载体在体外进行拼接重组,然后转入另一种生物体(受体)内,使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序,也称为分子克隆技术。因此,供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本元 件。

1 重组DNA技术与基因工程的基本概念 A 重组DNA技术与基因工程概念辨析 基因工程的定义 基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与应用,包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建(即重组DNA技术);而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞大规模培养、基因产物分离纯化、生物产品制造过程的工程化 (本讲座侧重于上游技术)。

1 重组DNA技术与基因工程的基本概念 B 重组DNA技术与基因工程的基本用途 分离、扩增、鉴定、研究、整理基因信息资源 规模化生产生物活性物质 设计、构建生物的新性状甚至新物种

分离、扩增、鉴定、研究、整理基因信息资源 从染色体DNA上定向分离目的基因 将获得的目的基因扩增至足够数量 采取加减法策略鉴定基因生物功能 gain of function loss of function 通过序列缺失研究基因内的功能域 根据同源基因序列整理生物进化树 GGTATCGTCATCTACTACGTGGCAAT

规模化生产生物活性物质 天然细胞 基因工程 采集 / 培养 蛋白质工程 途径工程 组织工程 基因工程 天然细胞 工程细胞 干细胞 工程干细胞 分离工程 发酵工程 分离工程 组织工程 细胞工程 酶 代谢工程 分离工程 酶工程 生物分子产品 组织器官 组织器官 生物分子产品

设计构建生物的新性状甚至新物种 天然物质或合成物质 野生细胞 突变细胞 基因敲除 基因导入 高通量筛选 野生动物 突变动物 基因敲除

1 重组DNA技术与基因工程的基本概念 C 基因工程的基本形式 第一代基因工程 蛋白多肽基因的高效表达 经典基因工程 第一代基因工程 蛋白多肽基因的高效表达 经典基因工程 第二代基因工程 蛋白编码基因的定向诱变 蛋白质工程 第三代基因工程 代谢信息途径的修饰重构 代谢途径工程 第四代基因工程 全基因组或染色体的操作 基因组工程

第一代基因工程:蛋白多肽基因的高效表达 经典基因工程 第一代基因工程:蛋白多肽基因的高效表达 经典基因工程 切 接 转 增 检

第二代基因工程:突变蛋白和融合蛋白定制 蛋白质工程 第二代基因工程:突变蛋白和融合蛋白定制 蛋白质工程 天然蛋白质编码序列 蛋白质功能域编码序列 突变蛋白 融合蛋白

第二代基因工程:全新蛋白设计 蛋白质工程 Nature 537 2016 天然存在蛋白 序列理论可能性20200种 定向进化蛋白 第二代基因工程:全新蛋白设计 蛋白质工程 Nature 537 2016 天然存在蛋白 序列理论可能性20200种 定向进化蛋白 天然存在序列1012种 全新设计蛋白

第三代基因工程:代谢信息途径的修饰重构 途径工程 第三代基因工程:代谢信息途径的修饰重构 途径工程 (合成生物学) 信号转导途径的遗传操作 物质代谢途径的遗传操作 FGF A 质膜 单基因操作 FGFR P 强化表达 / 导入基因 P B Grb2 P P 衰减表达 / 敲除基因 SOS 基 因 回 路 定点突变 / 基因洗牌 FRS C 基因回路 P Ras GDP GTP 多基因操作 MAPK MEK D 多模件重组 Raf P P P 多单链片段重组 核膜 E 转录机器全局工程 TF P P P F G

第四代基因工程:基因组工程 N. Annaluru et al. Science 344, 55, 2014 以野生型酿酒酵母第III号染色体的317kb序列为蓝本,作者设计并合成了一个273 kb长的功能性染色体模仿物synIII。改造内容包括:终止密码子的置换;亚端粒区、内含子、tRNA基因、转座子、交配位点a的删除及96个loxP元件的插入。这条人工设计和改造的染色体对细胞生长无损害,且表 现出多代遗传稳定性。

第四代基因工程:全基因组的克隆与编辑 基因组工程 第四代基因工程:全基因组的克隆与编辑 基因组工程 将化学合成的 蕈状支原体基 因组克隆在酵 母中,经甲基 化修饰后移植 到山羊支原体 受体细胞中。 由此生成了一个基因组最小化的蕈状支原体化学合成型活性细胞JCVI-syn3.0,仅含473个基因,但生长速度降低两倍。 J.C.Venter et al. Science 351, 1414, 2016

第四代基因工程:基因组工程 全基因组定点编辑 第四代基因工程:基因组工程 全基因组定点编辑 基因组工程的另一项最新进展是利用CRISPR-Cas9系统在哺乳动物活细胞内对基因组上的各基因进行定向敲除,并由此建立起基因与表型之间的因果关联。在该系统中,细菌来源的核酸内切酶Cas9能在短小单链RNA(sgRNA)的指导下,序列特异性地定位并作用于复杂基因组上,从而实现对哺乳动物大型基因组各区域的功能查询。T. Wang et al. Science 343, 80, 2014;O. Shalem et al. Science 343, 84, 2014

1 重组DNA技术与基因工程的基本概念 D 基因工程的基本原理 提高外源基因的剂量:分子遗传学原理 筛选修饰重组基因表达的转录调控元件:分子生物学原理 如:启动子、增强子、操作子、终止子、上游调控序列等 修饰构建蛋白质生物合成的翻译调控元件:分子生物学原理 如:SD序列、mRNA非编码区、密码子、polyA位点等 工程菌(微型生物反应器)的增殖及稳定生产:生化工程学原理

1 重组DNA技术与基因工程的基本概念 E 重组DNA与基因工程的支撑技术 核酸凝胶电泳技术 核酸分子杂交技术 细菌转化转染技术 寡核苷酸合成技术 基因定点突变技术 聚合酶链反应技术

1 重组DNA技术与基因工程的基本概念 A 重组DNA技术与基因工程的概念辨析 B 重组DNA技术与基因工程的基本用途 C 基因工程的基本形式 D 基因工程的基本原理 E 重组DNA与基因工程的支撑技术