第14章 细胞融合与单克隆抗体 14.1 细胞融合 14.2 杂种细胞的应用 14.3 淋巴细胞杂交瘤和单克隆抗体技术

14.1 细胞融合 14.1.1 细胞融合的机理及方法 14.1.2 病毒融合剂诱发细胞融合 14.1.3 化学融合剂聚乙二醇介导的细胞融合 14.1.4 细胞电融合 14.1.5 杂种细胞的筛选

灭活的病毒诱导的动物细胞融合

14.3 淋巴细胞杂交瘤和单克隆抗体 14.3.1 抗体的结构与功能 14.3.2 单克隆抗体的制备和生产 14.3.3 单克隆抗体的改造和应用

免疫系统 免疫细胞 (淋巴细胞、抗原呈递细胞 及白细胞、浆细胞、肥大细胞等) 淋巴组织 (弥散淋巴组织、淋巴小结) 中枢淋巴器官(胸腺、骨髓) 淋巴器官 周围淋巴器官(淋巴结、脾等) 免疫系统 淋巴细胞: T细胞：分细胞毒性T细胞、辅助性T细胞、 抑制性T细胞，参与细胞免疫。 B细胞：转化为浆细胞、参与体液免疫。 NK细胞：无需抗原提呈细胞、抗体，即可直接杀伤病变 细胞。

14.3.1 抗体的结构与功能 （1）抗原：进入动物体内对肌体的免疫系统产生刺激作用的外源物质。 --包括：蛋白质、多糖、核酸、病毒、细菌、各种细胞等。 --特点：外源性、结构性（分子表面具有稳定的环状结构基团作为识别位点）、特异性（抗原与抗体的反应）。

（2）抗体 是由抗原刺激B淋巴细胞转化为浆细胞后所产生，并能与相应抗原特异性结合、具有免疫功能的球蛋白，称为抗体（antibody,Ab）。 Ig：把具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白统称为免疫球蛋白。 免疫细胞：T细胞—— 细胞免疫 B细胞—— 体液免疫

Ig与Ab的关系 Ig Ab Ig是化学结构的概念，Ab 是生物学功能的概念。所有的Ab都是Ig，但Ig并非都有抗体活性。

抗体是由B细胞受抗原刺激后所分泌的蛋白质。 抗体分子： 由四条肽链所组成，两条重链（H链）两条轻链（L链）。 结 合 区： 抗体分子上有两个抗原结合区 可变区（V区）:与抗原特异性结合 稳定区（C区）:激活补体，穿过胎盘和粘膜等

可变区（variable region，V区） 恒定区（constant region, C区)： Ig的基本结构

通过小鼠B细胞杂交瘤（hybridoma）技术，制备的高度均一（属同一类、亚类、型别）、单一特异性，仅针对抗原上的一个抗原决定簇产生的抗体，为单克隆抗体（monoclonal antibody，McAb）。 优点：高效价，可大量生产 用天然的抗原物质免疫动物，刺激多个B细胞克隆所获得的免疫血清（含多种特异性抗体），称为多克隆抗体（polyclonal antibody，PcAb）。

14.3.2 单克隆抗体的制备和生产 (1) 单克隆抗体的制备 常规免疫血清抗体的制备 大量免疫动物，再从免疫过的动物抽取血清，是一个很费时的操作。 从动物血清得到的抗体中，除了希望得到的抗某种抗原的抗体外，往往杂有其他抗体。把需要的抗体纯化出来，也是一个费时的过程。 1975年Koehler及Milstein创立单克隆抗体技术，获1984年诺贝尔奖。

单克隆抗体（McAb）和常规免疫血清抗体的特性比较 项目 常规免疫血清抗体 McAb 抗体产生细胞 多克隆性 单克隆性 抗体的结合力 特异性识别多种抗原决定簇 特异性识别单一抗原决定簇 免疫球蛋白类别及亚类 不均一性，质地混杂 同一类属，质地纯一 特异性与亲合力 批与批之间不同 特异性高，抗体均一 有效抗体含量 0.01～0.1mg/ml（小鼠腹水） 0.5～5.0mg/ml(小鼠腹水) 0.5～10.0μg/ml（培养物上清液） 用于常规免疫学实验 可用 单抗组合应用 抗原抗体反应 抗体混杂，形成2分子反应困难，不可逆 可形成2分子反应，可逆

(1) 单克隆抗体的制备程序 动物免疫与亲本细胞的选择 细胞融合：淋巴细胞杂交瘤的制备 杂交瘤细胞` 的筛选 单克隆抗体的鉴定 杂交瘤细胞` 的筛选 单克隆抗体的鉴定 单抗克隆化培养和制备

① 亲本细胞的选择 骨髓瘤细胞：一般不分泌抗体，能在体外无限繁殖和连续继代培养，且为HPRT－（次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶）或TK－（胸腺嘧啶核苷激酶）。多用BALB/C 小鼠的骨髓瘤细胞。 常用骨髓瘤细胞株的特点 名 称 全 名 特 点 来 源 SP2/0 SP2/0-Ag14 不产生Ig BALB/C小鼠浆母细胞瘤 NS-1 P3-NS-1-Ag4/1 产生K轻链非分泌型 FO Fast-Zero Y3 Y3-Ag1.2.3 产生K Lou大鼠骨髓瘤 SKO-007 产生λε 人浆细胞瘤 TM-HZ 产生λK

BALB/c小鼠 1913年，贝格(Bagg)从美国商人欧希尔(Ohio)处购得的白化小鼠原种，以群内方法繁殖。麦克·多威尔(MacDowell)在1923年开始作近交系培育，至1932年达26代，命名为BALB/c品系。1985年我国从美国引进到中国医学科学院实验动物研究所，为BALB/c第180代。毛色：白化。 主要特性：①乳腺肿瘤自然发生率低，但用乳腺肿瘤病毒诱发时发病率高;卵巢、肾上腺和肺的肿瘤在该小鼠有一定的发生率。②易患慢性肺炎。③对放射线甚为敏感。④与其他近交系相比，肝、脾与体重的比值较大。⑤有自发高血压症，老年鼠心脏有病变，雌雄鼠均有动脉硬化。⑥对鼠伤寒沙门氏菌补体敏感，对麻疹病毒中度敏感。对利什曼原虫属、立克次氏体和百日咳组织胺易感因子敏感。 主要用途：广泛地应用于肿瘤学、生理学、免疫学、核医学研究，以及单克隆抗体的制备等。

淋巴细胞：经过免疫处理的淋巴细胞，多用大鼠或小鼠。 免疫方法：体内法或体外法。 体内法：对细胞或微生物抗原可直接注射如小鼠体内，可溶性蛋白抗原可与等量的福氏完全佐剂混合乳化后，注入到动物体内。3－4天后，在无菌条件下可以取出脾或淋巴结制成悬液，存活率在95％以上的可以用于融合。 体外法：直接提取大、小鼠淋巴细胞，调整为107个/ml，加适当浓度抗原，3－4天后，收集被刺激的淋巴细胞。

② 细胞融合 将免疫脾细胞和处于对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞以2：1或10：1的比例混匀于50ml锥形离心管内，1200rpm离心7—10分钟，尽量吸净上清液，用手指轻击管壁，使管底沉淀的细胞铺展成薄层，在室温条件下边轻轻振摇离心管边在60秒钟内逐滴加入50%的PEG 0.5ml，随后静置90秒，再于5分钟内边振摇边逐滴加入5－10ml不含血清的培液或盐水缓冲液，以终止PEG的作用，再静置10分钟。

③ HAT培养基筛选杂交瘤细胞 细胞团块分散后，加HAT溶液，稀释至骨髓瘤细胞不超过2×105 ml，即可加入有饲养细胞的96孔塑料培养板内每孔0.1ml，如是24孔板，每孔0.5ml；总量分别为0.2ml和1ml。 用HAT选择性培养时每隔2－3天半量换液，7天后可以选择出杂交瘤细胞。

细胞融合的选择示意图

HAT选择系统 HAT是含一定浓度次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）及胸腺嘧啶核苷（T）的一种选择性培养基，其中三种成分与细胞DNA合成有关。

杂交瘤技术中，常选用次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷（HPRT-）骨髓瘤细胞或胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）骨髓瘤细胞为亲本之一。 含氨基喋呤培养基抑制了细胞内嘌呤和嘧啶的全合成途径。

淋巴细胞具有合成DNA的两条途径。 杂种细胞通过互补作用获得HRPT或TK基因，可应用培养基中次黄嘌呤及胸腺嘧啶核苷，通过补救合成途径合成DNA。 在HAT培养基中，HPRT- 或TK- 亲本细胞死亡，淋巴细胞亦逐渐死亡，只有杂种细胞存活。

④ 特异性杂交瘤细胞的筛选 (单抗的鉴定) 通过选择性培养后生长的杂交瘤细胞，仅有部分是分泌预定特异性抗体的杂交瘤细胞。可取上清液，根据抗原的性质、抗体类型及所需灵敏度等具体情况来加以选择。 可溶性抗原可采用放射免疫、免疫酶标测定、间接血凝等方法测定。 细胞抗原可采用免疫荧光、51Cr释放试验、溶血空斑测定、补体依赖的细胞毒等方法直接测定针对这些抗原的抗体。

利用培养基对单抗进行鉴定的过程

⑤ 杂交瘤细胞的克隆化培养 利用单个细胞培养技术选育出遗传稳定的分泌特异抗体的细胞系。 在培养过程中，一般要加能释放某些生长因子促进杂交瘤生长的饲养细胞，如小鼠的腹腔巨噬细胞、脾细胞或胸腺细胞等。 方法有有限稀释法、软琼脂培养法、显微操作法、应用荧光激活分选仪等。

有限稀释法 通过适当的稀释达到分离单个细胞进行培养的目的 1）取出阳性孔内的细胞进行计数 2）用培液将其稀释到例如每毫升内10个细胞。 3）如果在96孔板内每孔加0.1ml，其机率将为每孔内落入一个细胞。 4）加入一定数量的饲养细胞，经过8~12天后，可观察到有集落生长的孔。 5）根据检测的阳性结果再次进行克隆化。

软琼脂培养法 在加入饲养细胞的无菌平皿内铺上一层0.5％的琼脂，待凝固后再铺上一层混有杂交瘤细胞的0.25％的软琼脂。待细胞长成集落后，用毛细管吸出移种于含饲养细胞的96孔板内。

(2)单抗的大规模生产 1）诱生腹水 将稳定分泌单抗的细胞株，通过扩大培养，接种于Balb/c小鼠腹腔内，使其以腹水瘤形式在小鼠腹腔内增殖，从而得到大量含单抗的腹水。 方法是将降植烷或石蜡油注入Balb/c小鼠腹腔，0.5ml/只，7天后腹腔接种3~5×106 杂交瘤细胞。10~20天后即可抽取腹水，每毫升腹水中约含1~10mg单抗。 2）利用微载体、微囊、旋转瓶、中空纤维培养系统等进行大规模培养。 3）生物反应器培养杂交瘤细胞大规模生产单抗

(3) McAb技术的特点 高度特异性 高度稳定性 高抗体活性 不可知性 过于单一性

14.3.3 单克隆抗体的改造和应用 （1）单克隆抗体的改造 抗体研究的世代 第一代 多克隆抗体 第二代 单克隆抗体 第三代 基因工程抗体

HAMA反应的示意图 影响单抗与靶细胞或抗原结合 引起变态反应和器官损害

嵌合抗体 重构抗体 人源抗体 小鼠抗体

基因工程抗体制备的技术基础 大肠杆菌直接表达功能抗体片段 PCR技术 噬菌体展示技术：筛选＋扩增

①杂交人－鼠单克隆抗体 鼠-人杂交瘤技术已获突破 鼠源抗体一般无法有效地激发宿主的免疫防卫系统，还可能引发人对鼠源抗体本身的免疫反应。 在抗体中，Fc片段在抗体中的作用是激活机体免疫反应。 对鼠源抗体进行改造，利用人源的Fc区域的DNA片段替换鼠源单抗的Fc的DNA片段。 嵌合抗体可以保留其目标专一性，降低人的抗鼠反应。 鼠-人杂交瘤技术已获突破

②人源单克隆抗体 方法1：分离人B细胞，使之与荧光标记的抗原相结合，通过荧光标记选择能产生特殊抗体的B细胞，并用Epstein－Barr病毒转化，得到少量的单抗。 方法2：将人源免疫干细胞导入缺失大部分免疫细胞的小鼠体内，遇到抗原时，产生人源的抗体。 方法3：将改造过的人的抗体基因导入鼠胚胎中，能在免疫后得到产生人抗体的转基因鼠 Karpas A(2001)报道建立了人-人杂交瘤技术，获得Karpas 707H人骨髓瘤细胞株。

转人Ig基因组小鼠 基因敲除小鼠 转入人的Ig基因组 免疫动物 人抗体

③ 抗体融合蛋白 将抗体的可变区与一非抗体蛋白融合起来，使融合蛋白继承有抗体分子的结合特异性。可以保留不同程度的抗体结合特异性和激发其他免疫反应的能力。

④ 单链抗体 在大肠杆菌的系统中，可以表达VL－衔接物－VH的序列，产生单链抗体。 单链FV片段:抗体体积小、免疫原性较低，渗透性好，用于实体肿瘤的诊断和治疗。 生物导弹：利用单链抗体序列接上一段药物蛋白的编码序列，表达后的蛋白可以根据抗原抗体反应，而达到专一性治疗疾病的目的。 双功能抗体片段：两个抗原结合特异性不同的Fab或Fv片段通过二硫键连接起来，如一个结合肿瘤特异性抗原，一个结合杀伤性T细胞，这样识别和消灭肿瘤细胞的功能可以统一在一个单链抗体分子上。

　 人淋巴细胞　　　　 　抗原筛选产生特异克隆 　　RT-PCR　　　　 　轻链重链基因　　　　　　　　　 　转印至NC DNA重组 　 组合抗体库　　　　　　　　　　　 E.coli随机表达

(2) 单克隆抗体的应用 单抗作为体内体外诊断试剂在临床生化诊断、病理组织定位、体内肿瘤的定位等 单克隆抗体靶向制剂（生物导弹），治疗癌症等疾病 杂交人－鼠单克隆抗体 McAb亲和层析对生物大分子的分离纯化，如基因工程人a干扰素

①单抗作为体内体外诊断试剂 现在已经有各种不同类型的单抗试剂盒在市场出售，例如乙型肝炎的表面抗原，铁蛋白、促绒毛膜性激素、促甲状腺激素、癌症、艾滋病等诊断试剂。 用同位素标记的单抗在特定的组织中成象的技术可以用于肿瘤、心血管畸形的体内诊断。

②单克隆抗体靶向制剂 1）药物与单抗直接偶联 通过化学反应使药物分子的氨基与抗体分子的羧基之间直接形成稳定的酰胺键。 利用氧化剂把药物分子上的糖基氧化成羰基。 利用羰基与抗体分子的氨基反应形成西佛氏碱，最后还原。 这样的靶向制剂保留一定的药物活性，并具有一定的选择性。 如：1，4－溴柔红霉素与肿瘤细胞单抗形成的偶合物，对肿瘤有明显的选择性毒性。

2）药物通过小分子与单抗连接 通过一些小分子交联剂，把药物分子上的某些基团连接起来。 小分子交联剂：如同型双功能试剂，包括戊二醛、顺乌头酸酐、马来酸酐、戊二酐；异型双功能试剂：N－琥珀酰胺基－3－丙酸和寡肽等。 顺乌头酸酐制成的最常用，在中性条件下较稳定，在酸性条件下容易发生水解。这种靶向试剂与肿瘤的表面抗原结合后，会进入溶酶体，在酸性环境下释放药物，而杀死肿瘤细胞。

3）药物通过大分子与抗体相连 大分子聚合物：葡聚糖、多聚赖氨酸、多聚谷氨酸、聚合多肽和血清蛋白等。 总之，利用单抗试剂盒可以作为靶向药物，针对肿瘤、自身免疫系统疾病、各种病原体病等。

已批准上市的单抗 适用病症 靶抗原 抗体名称 抗体来源 临床阶段 移植排斥 大肠癌 冠心病 淋巴瘤 炎症性肠病、 类风湿 CD3 17-1A 血小板受体ⅡbⅢa CD20 CD25 TNF- а OKT3 Panorex ReoPro Rituxan Simulect Remicade 鼠单抗 人－鼠嵌　合抗体 1986 1995(德国) 1994 1997 1998 1998、1999

适用病症 靶抗原 抗体名称 抗体来源 临床阶段 移植排斥 乳腺癌 RVS感染 AML CLL CD25 HER-2 RSV F蛋白 CD33 CD52 Zanapax Herceptin Synagis Mylotarg CAMPATH 人源化抗体 人源化抗体－化疗药物交联物 1997 1998 2000 2001

正在进行临床开发中的基因工程抗体 适用病症 靶抗原 抗体名称 抗体来源 临床阶段 银屑病 IL－8 CD11a(IgG1) ICAM-3 ABX－IL8 Anti-CD11a ICM3 IDEC-114 MEDI-507 Smart anti-CD3 Human(人源) Humanized (人源化) Humanized Primatized Humanized( IgG) Ⅱ Ⅰ，Ⅱ 临床前 Ⅰ Ⅰ/Ⅱ

适用病症 靶抗原 抗体名称 抗体来源 临床阶段 风湿性关节炎 Complement(C5) TNF-а CD4 5G1.1 D2E7 CDP870 Infliximab IDEC-151 MDX-CD4 Humanized Human Humanized ( Fab) Chimeric(IgG1)(嵌合) Primatized (IgG1) Human (IgG) Ⅱ Ⅲ FDA批准（1999） Ⅰ

适用病症 靶抗原 抗体名称 抗体来源 临床阶段 克罗恩病，节段性回肠炎 溃疡性结肠炎 自身免疫病 TNF-а а4ß7 CD4 CD3 Infliximab CDP571 LDP－02 OrthoClone OKT4A Smart anti-CD3 Chimeric(IgG1) Humanized(IgG4) Humanized Humanized( IgG) FDA批准（1998） Ⅱ Ⅰ/Ⅱ

适用病症 靶抗原 抗体名称 抗体来源 临床阶段 系统性红斑狼疮 多发性硬化症 C5 CD40L Complement(C5) VLA-4 5G1.1 Antova IDEC-131 MEDI-507 Antegren Humanized Humanized (IgG) Humanized( IgG) Ⅰ Ⅱ(继续) Ⅱ Ⅰ/Ⅱ

适用病症 靶抗原 抗体名称 抗体来源 临床阶段 自身免疫出血性病症 气喘/变态反应 CD64(FcgR) IL-5 IL-4 IgE CD23 MDX-33 SCH55700 SB-240563 SB-240683 rhuMab-E25 IDEC-152 Human Humanized (IgG4) Humanized Humanized( IgG1) Primmatized Ⅱ Ⅲ Ⅰ

适用病症 靶抗原 抗体名称 抗体来源 临床阶段 移植物抗宿主疾病 同种异体移植排斥 CD147 CD2 CD3 ABX-CBL BTI-322 MEDI－507 Orthoclone/OKT3 SMAT anti-CD3 Murine(IgM)(小鼠) Rat(IgG)(大鼠) Humanized Murine(Ig2a) Ⅲ Ⅱ Ⅰ/Ⅱ FDA批准（1996）

适用病症 靶抗原 抗体名称 抗体来源 临床阶段 同种异体移植排斥 CD25 ß2-integrin CD4 CD147 Zenapax Simulect LDP-01 OKT4A ABX-CBL Humanized (IgG1) Chimeric (IgG1) Humanized (IgG) Murine(IgM) FDA批准（1997） FDA批准（1998） Ⅰ/Ⅱ а Ⅱ Ⅲ

适用病症 靶抗原 抗体名称 抗体来源 临床阶段 同种异体移植排斥 中风 青光眼 抗凝血剂 CD40L CD18 ß2-integrin TGF－ ß2 Fact Ⅶ Antova Anti-LFA-1 LDP-01 CAT-152 Corsevin M Humanized (IgG) Murine [F(ab’)2] Human Chimeric(Fab) Ⅰ/Ⅱ(继续) Ⅲ Ⅰ/Ⅱ а Ⅱ Ⅰ

适用病症 靶抗原 抗体名称 抗体来源 临床阶段 冠状血管成形术并发症 心肌梗死 罗氏肉瘤病毒 Glycoprotein ⅡbⅢa receptor PDGF ßR CD18 F protein ReoPro Abciximab CDP860 Anti-CD18 Synagis Humanized (IgG) Humanized [F(ab’)2] Humanized (IgG1) Ⅰ/Ⅱ а Ⅱ FDA批准（1998）

适用病症 靶抗原 抗体名称 抗体来源 临床阶段 艾滋病 乙型肝炎 巨细胞病毒 中毒性休克 一般癌症 Gp120 Hep B CMV TNF-а CD14 VEGF PRO542 Ostavir Protovir MAK-195 (SEGAND) IC14 Anti-VEGF CD4 fusion Human Murine [F(ab’)2] ? Humanized (IgG1) Ⅱ Ⅱ(批准) Ⅲ Ⅰ

适用病症 靶抗原 抗体名称 抗体来源 临床阶段 卵巢癌 结肠病 肺病 头、颈部病变 CA125 17-1A Cell surface antigen Anti-idiotypic GD3epitope EGFR OvaRex Panorex BEC2 IMC－C225 Murine Murine (IgG2a) Murine(IgG) MerckKGaA Chimeric (IgG0 Ⅱ/Ⅲ 德国批准（1995） Ⅲ

适用病症 靶抗原 抗体名称 抗体来源 临床阶段 乳腺病 慢性淋巴细胞白血病 急性粒细胞白血病 非何杰金淋巴瘤 HER2/neu CD52 CD33 CD20 CD22 Herceptin Campath1/ ( LDP03) Smart Rituxan LymphoCide Humanized (IgG1) Humanized　(IgG1) M195 Chimeric (IgG1) Humanized(IgG) FDA批准（1998） 生物制品许可申请 蛋白质设计 FDA批准 Ⅰ/Ⅱ

适用病症 靶抗原 抗体名称 抗体来源 临床阶段 非何杰金淋巴瘤 黑色素瘤 HLA HLA DR 抗id(GD2)* Smart 1D10 Oncolym (Lym-1) TriGem Humanized Radiolabelled murine Murine Ⅰ Ⅱ/Ⅲ Ⅱ

人源抗体制备技术日臻成熟，全分子人抗体研究具有诱人的前景，临床应用有望进一步扩大，我国在抗体工程研究中应注重原创性，力争在国际竞争中占有一席之地。