微小RNA及其在医学中的应用

一、微小RNA的发现 人类基因组中，蛋白质编码区只占1-2％。其它98％的基因组有什么功能呢？约24％为内含子序列，这么冗长的内含子序列有什么生物学功能呢？

后基因组时代的中心法则 基因组的保持 DNA 修复和重组 基因组的表达 RNA 加工 基因调节

后基因组时代的基因调控：RNA 调控

人类基因组绝大部分被转录成RNA 非编码RNA的数量是编码RNA的数百倍 生物体复杂性被隐藏在它们所输出的非编码RNA内，而非编码序列内。

2006年的诺贝尔生理学奖获得者： Andrew Z. Fire Craig C. Mello

微小RNA（microRNA, miRNA）的发现 Victor Ambros Gary Ruvkun 第一个被发现的miRNA (lin-4)由哈佛大学的Victor Ambros 发现的（1993） 第二个被发现的miRNA（let-7）由哈佛大学的博士后Frank Slack (Ruvkun 实验室）发现的（2000)

第一个被发现的miRNA: lin-4 Ruvkun G, Wightman B, Ha I. The 20 years it took to recognize the importance of tiny RNAs. Cell. 2004 Jan 23;116 (2 Suppl):S93-6. Lee R, Feinbaum R, Ambros V. A short history of a short RNA. Cell. 2004 Jan 23;116 (2 Suppl):S89-92

近年来被鉴定的miRNAs越来越多 至今超过17000 miRNAs已被发现 可以免费获得 http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/

二、微小RNA的特点

微小RNA的作用特点 主要是在蛋白质水平调控 ５’端２-８个核苷酸高度保守，主要作用在靶mRNA的３’端非翻译区（unstranslated region, UTR） 分完全和不完全配对两种方式，哺乳动物主要为不完全配对结合，影响mRNA的成熟、转运、稳定性或者在直接调控翻译 是翻译抑制还是剪切mRNA，除配对因素外，还取决于RISC中组装元件的功能，如Arg蛋白

小干扰RNA（small interfering RNA; siRNA） 和微小RNA的异同点

siRNA和miRNA的相同点 相同点 siRNA miRNA 长度 22nt左右 合成的底物 由双链RNA或RNA前体形成的 Dicer酶 Argonaute家族 需要Argonaute家族蛋白参与 蛋白RISC组分 都是RISC组分，其功能界限变得不清晰，如二者在介导沉默机制上有重叠 作用方式 在转录水平后和翻译水平起作用

不同点 siRNA miRNA 机制性质 外源引起，如病毒感染诱导产生，异常情况 生物体自身的正常调控机制 直接来源 长链双链RNA 发夹miRNA前体 分子结构 双链RNA 单链RNA 对靶RNA特异性 较高 相对较低 互补性 一般要求完全互补 不完全互补，存在错配现象 生物学功能 抵抗病毒感染； 沉默过分表达的mRNA； 保护基因组免受转座子的破坏 对机体生长发育，神经分化，脂类代谢，细胞增殖分化，肿瘤发生有重要作用

三、微小RNA的主要功能 疾病 发育 增殖 (干细胞) miRNA 分化 凋亡

1. 调控发育过程 Victor R. Ambros 秀丽线虫 C. elegans

miRNA的表达具有组织特异性 斑马鱼 青鳉 小鼠 果蝇 miR-124a局限表达于神经组织 miR-1局限表达于骨骼肌和心肌

2. 调控细胞分化 3种miRNA控制造血干细胞向淋巴细胞的分化过程 ( Science 2004)

3. miRNAs与心血管疾病 （调控心肌前体细胞 的增殖）

4、miRNA 与病毒感染 microRNA 禽流感病毒 HBV,HCV 逆转录病毒家族 多瘤病毒家族 host or virus Avian influenza virus 　疱疹病毒家族 EBV,KSHV,MHV-68, HCMV,HSV-1 HBV,HCV 逆转录病毒家族 HIV-1 多瘤病毒家族 SV40(Simian virus 40) 　腺病毒家族 hAV(adenovir)

miRNA与肝炎病毒 诊断、治疗 HBV ≠ ≠ ≠ ≠ 基因表达 信号传导 肝细胞肝癌发生、发展 miRNA HCV

在肝炎模型中发现的肿瘤相关miRNA HBV HCV has-let-7a ras and c-myc genes has-miR-34 p53 tumor supressor pathway has-miR-191 Worse survival in acute myeloid leukemia HBV has-miR-133b Sequamous cell carcinoma has-miR-142-5p Hematopoietic specific HCV Normal

5.微小RNA与肿瘤的关系

微小RNA调控癌基因表达

下调miRNA表达，促进了E2F1的表达 NorternBlotting Western Blotting

有些微小RNA可能是致癌基因 mir-17–92高表达

增加mir-17–19b的表达，加速了c-myc诱导的淋巴瘤形成

miRNAs与肿瘤的关系

miRNA与疾病关系的研究策略 诊断 哪些重要的miRNA影响到 某种生命活动 治疗 miRNA在什么时候、 在哪里表达 的靶基因 哪些miRNA表达 分离,克隆,测序 功能分析 哪些重要的miRNA影响到 某种生命活动 治疗 miRNA文库筛选

四、微小RNA与胃癌的关系 (一)胃癌概述 胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一。 中老年发病较多，男女比例约2比1 全球肿瘤发病和癌症死亡率的第二位。

(二)目前胃癌诊治的现状 早期胃癌多无症状或仅有轻微症状。当临床症状明显时，病变已属晚期。 进展期胃癌，从症状出现到死亡，平均约1年。胃癌5年总生存率一般在10%左右。 胃癌缺乏早期特异性的肿瘤诊断标志物，现有肿瘤标志物如CEA灵敏度仅40%，使肿瘤常常发生浸润转移 肿瘤药物化疗、放射线手段副作用大。对患者正常细胞伤害较大，亟需高特异性的肿瘤药物

(三)技术路线 临床研究 体外实验 功能分析 定量RT-PCR miRNA芯片 胃癌组织 癌旁组织 总 RNA 提取 胃癌组织　　癌旁组织 (三)技术路线 临床研究 体外实验 功能分析 　总 RNA 提取 miRNA芯片 定量RT-PCR 组织类型 细胞分化 侵润深度 TNM分期 转移 细胞培养, MGC803, SGC-7901 反义寡核苷酸阻断miRNA的表达 生长曲线MTT 定量PCR检测 细胞周期　凋亡检测 靶基因分析 综合分析确定miRNAs可能的致癌机制

(四)胃癌组织中微小RNA的表达谱 芯片分析胃癌组织中异常表达的微小RNA 19种差异表达的微小RNA 12  7  12  7  miR-139-5p，miR-497和miR-768-3p首次在非肿瘤组织中发现 miR-340*、miR-421和miR-658首次在癌组织中发现高表达 Guo J, et al. J Gastroenterol Hepatol. 2009, 24(4): 652-657

(五)临床病理因素分析结果 高表达的微小RNA（miR-106a）与胃癌分期的关系 Xiao B, Guo J, et al. Clin Chim Acta. 2009;400(1-2):97-102.

miR-106a异常表达的临床意义 因素 病例数 变化倍数 P 直径 ≥5cm 30 68.59  258.49 <0.001 分化 中 23 7.36  15.48 <0.001 低 22 59.62  299.13 淋巴结转移 + 46 50.69 209.88 <0.001 - 9 10.24 20.52 远处转移 + 9 142.35  414.60 <0.001 - 46 24.84  107.37 侵润 T1 2 0.14  0.04 T2 26 6.09  12.72 <0.001† T3 17 50.49  173.91 =0.005‡ T4 10 140.69  390.79

实时定量PCR 结果 癌组织中mir-421的表达明显高于癌旁组织 Jiang C, Guo J, et al. Journal of Gastroenterology. DOI 10.1007/S00535-009-0135-6

体外实验结果 合成特异性微小RNA引物、用未转染肿瘤细胞中的对照，比较转染后癌细胞中微小RNA表达的变化 蒋振，郭俊明，等. 中国病理生理杂志 2009, 25(9): 1726-1730.

下调miR-421表达对胃癌细胞生长的影响 Jiang C, Guo J, et al. Journal of Gastroenterology. DOI 10.1007/S00535-009-0135-6

miR-421靶蛋白实验结果 筛选微小RNA匹配度最高的肿瘤相关靶基因、检测靶基因在蛋白质水平上的变化 Jiang C, Guo J，et al. Journal of Gastroenterology. DOI 10.1007/S00535-009-0135-6

肿瘤抑制基因Rb和PTEN 分别受到miR-106和miR-21的调控; E2F1受到miR-17-92基因簇调控 胃癌相关微小RNA的功能研究 肿瘤抑制基因Rb和PTEN 分别受到miR-106和miR-21的调控; E2F1受到miR-17-92基因簇调控 癌旁 癌 Rb PTEN E2F1 免疫组化 Guo J, et al. J Gastroenterol Hepatol. 2009, 24(4): 652-657

结 论 实验显示，miR-421在胃癌中显著高表达，下调miR-421的表达可以抑制胃癌细胞的生长，它可能是一个潜在的胃癌治疗靶点 结 论 实验显示，miR-421在胃癌中显著高表达，下调miR-421的表达可以抑制胃癌细胞的生长，它可能是一个潜在的胃癌治疗靶点 miR-421发生的初期阶段中可能起重要作用,它可能是一个新的胃癌诊断候选标志物 通过临床病例检测， miR-421在肿瘤病人中阳性率为73.33%，阳性率较高优于现在临床胃癌标志物CEA检出灵敏度（仅40%）