第四部分 ＤＮＡ重组技术 －－ＤＮＡ的酶切、回收和连接转化

ＤＮＡ的酶切反应 　分子生物学中经常使用的是II型限制性内切酶。它能识别双链ＤＮＡ分子中特定的靶序列（4～8bp),并在该序列内切断ＤＮＡ，形成特有的粘末端或平端。

一、实验目的 掌握ＤＮＡ酶切的基本原理。 学习和了解限制性内切酶的使用方法。 学习和掌握ＤＮＡ片段胶回收的方法

二、实验原理 1. 核酸限制性内切酶是在原核生物中发现的一类专一识别双链ＤＮＡ中特定碱基序列的核酸水解酶，它们的功能类似于高等动物的免疫系统，用于抗击外来ＤＮＡ的侵袭。现已发现几百种限制性内切酶，它们以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯键，产生的ＤＮＡ片段5’端为P，3’端为OH。由于限制性内切酶能识别ＤＮＡ特异序列并进行切割，因而在基因重组、ＤＮＡ序列分析、基因组甲基化分析、基因物理图谱绘制及分子克隆等技术中收到广泛应用。

三、试剂与器材 （一）试剂 限制性内切酶；10×内切酶缓冲液 T4ＤＮＡ连接酶；10×连接酶缓冲液 电泳缓冲液 1×TAE 琼脂糖；溴酚兰；  （一）试剂 限制性内切酶；10×内切酶缓冲液 T4ＤＮＡ连接酶；10×连接酶缓冲液 电泳缓冲液　1×TAE 琼脂糖；溴酚兰； 溴化乙锭(工作浓度0.5µg/ml) 酚；氯仿；无水乙醇；70%乙醇；灭菌双蒸水

（二）实验器材 1．电泳仪、电泳槽、紫外检测仪、摄影设备 2．恒温水浴槽

四. 操作步骤 酶切反应 1.设计酶切体积为20~30μl，计算清楚酶切系统中 各成分的用量，清晰做好记录，如果是同一条件下 进行多个酶切反应，建议统一加好共同的组分后， 分装； 2.先加入正确体积的无菌双蒸水，加入1/10体积 的10x酶切缓冲液，混匀； 3.在冰浴条件下加入适量的限制性内切酶； 4.加入适量的ＤＮＡ样品； 5.弹匀，短暂离心；

6.置所用限制性内切酶最适温度水浴中，酶切1~3小时，酶切 过夜则建议改用稍大的酶切体积，以避免水分蒸发过多影响的 酶切体系各组分浓度改变过大; 7.置65℃水浴中10分钟，对限制性内切酶进行灭活，不同的酶 灭活条件可能不同，请参照说明书进行; 8.进行琼脂糖凝胶电泳检测酶切反应的结果; 9.反应体系： 10×内切酶缓冲液 2l ＤＮＡ 1-1.5g 限制性内切酶 2-5单位 用灭菌的ddH2O补至20l，37℃ 1小时。可根据需要按 比例放大。

五.注意事项 影响限制性内切酶活性的生物因子： 酶切割位点周围核苷酸两侧的碱基的性质； 识别序列在ＤＮＡ中的分布频率； 与ＤＮＡ的构象有关（SC,L,OC）； ＤＮＡ的纯度（蛋白、氯仿、SDS、EDTA、甘油等）；

内切酶用量不超过总反应体积的10%； 消化时间适当延长有利于提高酶活性； 加ＤＮＡse-free的BSA 可以起到稳定酶活性的作用； 用硅化处理的器皿进行酶切可以提高酶活性； 酶切所用器皿和ddH2O要经过高温灭菌方可使用； ＤＮＡ样品应不含重金属离子

ＤＮＡ片段的胶回收 电泳洗脱法 低熔点琼脂糖凝胶电泳挖块法 冻融回收法 玻璃奶回收法 柱回收法（按说明书进行） 胶回收后用30-50 μl无菌双蒸水洗脱ＤＮＡ片段，取1-5 μl进行电泳检测，取2-5 μl测定OD260下的光吸收值，计算ＤＮＡ的浓度。 注：1 OD 260相当于双链ＤＮＡ浓度为50 μg /ml

胶回收注意事项 将电泳槽用ddH2O反复清洗干净, 倒入新鲜配制的灭菌电极缓冲液； 根据点样量制备合适厚度的琼脂糖凝胶板； 切胶时尽可能切掉不含ＤＮＡ片段的凝胶； 要尽量减少ＤＮＡ在紫外下的照射时间以减少对ＤＮＡ的损伤； 熔胶要完全 。

ＤＮＡ的连接 在T4ＤＮＡ连接酶的作用下，平端或带有相同粘末端的ＤＮＡ分子可以连接上。ＤＮＡ连接酶的作分三步： T4ＤＮＡ 连接酶与辅助因子ATP形成酶-AMP复合物。 酶-AMP复合物再结合到具有5’-磷酸基和3’羟基切口的ＤＮＡ分子上，使ＤＮＡ腺苷化。 产生一个新的磷酸二酯键，把缺口封起来。

当我们已经获得目的基因片段，选择好适当的克隆（或表达，转化）质粒载体， 并确定重组方案后，下面要进行的就是ＤＮＡ片段之间的体外连接，从而获得重组子。 此重组子可转入相应的宿主菌中用于对目的基因的扩增以及目的基因表达（如现代基因工程药物的生产），还可用于序列分析和转基因等重要生物技术的研究中。

1、ＤＮＡ分子的体外连接 ＤＮＡ分子的体外连接就是在一定条件下，由ＤＮＡ连接酶催化两个双链ＤＮＡ片段组邻的５’端磷酸与３’端羟基之间形成磷酸酸脂键的生物化学过程，ＤＮＡ分子的连接是在酶切反应获得同种酶互补序列基础上进行的。

连接反应中值得注意的几个问题： 1.ＤＮＡ连接酶 常用的ＤＮＡ连接酶有两种： (1)来自大肠杆菌的ＤＮＡ连接酶 (2)来自噬菌体的Ｔ４ＤＮＡ连接酶。 二者的作用机理类似。

Ｔ４ＤＮＡ连接酶作用机制 Ｔ４连接酶作用分三步： １.Ｔ４ＤＮＡ连接酶与辅助因子ＡＴＰ形成酶－ＡＭＰ复合物。 ２.酶－ＡＭＰ复合物结合到具有５’－磷酸基和３’－羟基切口的ＤＮＡ上，使ＤＮＡ腺苷化。 ３.产生一个新的磷酸二酯键，把缺口封起来.

2.连接反应的温度 ＤＮＡ连接酶的最适反应温度为３７℃， 但在此温度下， 粘性末端的氢键结合很不稳定，折衷方法是１２℃过夜。

3. ＤＮＡ的平末端和粘性末端 由于内切酶产生的ＤＮＡ末端有平末端和粘性末端，因而连接反应中就有平未端连接和粘性末端连接。 二者连接效率不同。 粘性末端效率高，因而在底物浓度，酶浓度选择上是有差异的，

4.碱性磷酸酶处理质粒载体 为了提高连接效率，一般采取提高ＤＮＡ的浓度，增加重组子比例。这样就会出现ＤＮＡ自生连接问题， 为此通常选择对质粒载体用碱性磷酸酶处理，除去其５’末端的磷酸基，防止环化， 通过接反应后形成的缺口可在转化细胞后得以修复。

5.连接反应的检测 连接反应成功与否，最后的检测要通过下一步实验，转化宿主菌， 阳性克隆的筛选来确定。 我们下面的实验从粘性末端为例操作。

实验试剂 １．纯化后的酶切质粒载体和目的基因。 ２．１０×Ｔ４ＤＮＡ连接酶buffer 200mM Tris-HCl(pH7.6) 50mM MgCl2 50mM 二硫苄糖醇 500μg/ml BSA ３．Ｔ４ＤＮＡ连接酶 ４．5mM ATP

实验方法 ＤＮＡ分子的体外连接 １．在无菌Eppendorf管中加入以下溶液： a. 0.1μg质粒载体，２倍分子的外源ＤＮＡ。 b. 加无菌水至7.5μl，于４５℃加温５分钟使重新 退火的粘端解链， 将混合物冷却到０℃。 c. 加入： １０×Ｔ４ＤＮＡ连接酶buffer 1μl Ｔ４ＤＮＡ连接酶 0. 1μl 5mM ATP 1μl ２．盖上管盖，充分混匀，台式离心扣上离心５秒。 ３．１２℃下过夜连接反应。 ４．反应结束后于－２０℃保存。

结果与分析 电泳检查连接结果： 如何判断连接效果的成功性？

问题与讨论： １．简述Ｔ４ＤＮＡ连接酶作用机理。 ２．简述一个完整外源ＤＮＡ的克隆过程。 ３．连接反应中应注意些什么问题及如何提高连接效率。

ＤＮＡ的转化及转化子的筛选 实验目的及背景： 体外通过基因工程手段所构建的含目的基因的重组质粒，选用转化和筛选技术， 可获得含重组的阳性克隆。在此阳性克隆中，ＤＮＡ可在生物体系中大量扩增，繁殖， 保存以及表达目的基因的产物，这是ＰＣＲ体外扩增ＤＮＡ所不能替代的。配合ＤＮＡ重组技术，所获得的，不同目的需要的阳性菌株已广泛应用于科研，医药生产和生物发酵等领域。

制备感受态细胞 现在制备感受态细胞通常用CaCl2处理，在低温 中与外来ＤＮＡ分子相混合. ＤＮＡ分子转化分以下几步: １．吸附－－双链ＤＮＡ分子吸附于受体菌表面； ２．转入－－双链ＤＮＡ分子解链。一条链进入受体菌，另一条降解； ３．自稳－－外源质粒ＤＮＡ分子在细胞内复制成双链； ４．表达－－供体基因随同复制子同时复制，分裂， 转录翻译。

重组子的筛选 这和受体菌：质粒ＤＮＡ的选择相关， 原则上要注意： １．受体菌必须是限制与修饰系统缺陷的菌株； ２． 根据质粒基因型和受体菌基因型互补原则而定。 重组子的筛选方法常用的有两种方法：

１.抗生素筛选法 菌株为某种抗生缺陷型， 而质粒上带有该抗性基因（如氨苄青霉素， 卡拉霉素等）这样只有转化子才能在含该抗生素的培养基上长出。 本实验利用抗生筛选转化子。

２.互补法 现在使用的许多载体（如ＰＵＣ系列）有含有一个大肠杆菌ＤＮＡ的短区段，其中含有β－半乳糖苷酸基因（lacZ）的调控序列和头１４６个氨基酸偏码区。这个偏码区中插入一个多克隆位点。 受体菌则含编码β－半乳糖苷酶Ｃ端ａａ的序列。当外源基因插入时，二者溶为一体后，有β－半乳糖苷酶表达， 在生色底物５－溴－４－氯－３－吲哚－β－Ｄ－半乳糖苷（x-gal）培养基中形成兰色菌落。 而当有外源基因插入到多克隆原点，从而造成插入失活，而使lacZ基因不表达而形成白色菌斑。 通过颜色不同而区分重组子和非重组子。

实验试剂 ＬＢ培养基 质粒ＤＮＡ（含Amp抗生基因），受体菌 CaCl2 0.1M Amp

实验方法 一、感受态细胞制备 １．将宿主菌在琼脂培养基平板上划线，37℃培养16~20小时。 ２．挑取单菌落转入20ml LB培养基锥瓶中，37℃振荡过夜。 ３．从中取２ml菌液转入50mlＬＢ培养基中37℃振荡培养4~5小时， 测ＯＤ600达0.4~0.5。 ４．培养物于冰上１０分钟。 ５．转入50ml离心管，于4000rpm下4℃离心10分钟。 ６．弃上清，倒置离心管1分钟，流尽剩余残液然后加入10ml用冰预冷的 0. 1mol/L CaCl2，置冰上10分钟。 ７．4,000rpm 4℃离心10分钟，弃上清。 ８．加入2ml，0.1M CaCl2悬浮细胞，于4℃过夜。

二、转化 １．在１.５ml Eppendorf管中加入２００μl感受态细胞和１０μl ＤＮＡ （４０ng）溶液， 温和混匀，于冰上３０分钟。 ２．于４２℃水浴９０秒。 ３．冰浴２分钟。 ４．加入８００μl LB液体培养基 　　　３７℃４５分钟。 ５．取２００μl涂布于含Amp(５０μg/ml)琼脂糖平皿，３７℃培养１２～１６小时，观察结果。

注意事项 -80℃冰箱储存的感受态细胞在5-6周后，转化率很低。可用一已知标准闭环质粒鉴定感受态细胞的转化能力。 用无ＤＮＡ转化物的感受态细菌铺板，若有菌落生长，说明其中抗生素浓度不够或有杂菌污染。

结果与分析 １．计算转化率。 ２．根据转化率和阴性对照分析实验结果。

问题与讨论： １．根据本实验认为影响转化率的因素有哪些？ ２．抗性法筛选和互补筛选原理是什么？