任务1-7 菌种的保藏

一、菌种保藏的目的 ①菌种存活，不丢失，不污染 ②防止优良性状丧失 ③随时为生产、科研提供优良菌种

二、菌种保藏的原理： 首先，选用优良的纯种（最好是休眠体，如分生孢子、芽胞等） 其次，创造微生物代谢不活波，生长繁殖受抑制，难以发生突变的环境条件（其环境要素是干燥、低温、缺氧、缺营养 以及添加保护剂等） 再次，添加保护剂或酸碱中和剂，避免保藏过程中细胞受伤。

三、菌种保藏的方法 斜面保藏法 穿刺保藏法 沙土管干燥保藏法 真空冷冻保藏法 液氮保藏法 低温保藏法

斜面低温保藏法 方法：接种适宜斜面培养基 →培养→4℃保藏 原理：低温下，微生物代谢强度明显下降 适用：各大类 保藏期：3-6个月 缺点：保存期短，传代多，易退化

半固体穿刺保藏法 方法：适宜半固体→培养→4℃保藏 原理：缺氧、低温 适用：好气性细菌，酵母等 保藏期：6-12个月 步骤： 用接种针从原菌种斜面上挑取少量菌体，从柱状培养基中心自上而下刺入，至培养基的1/2处，待微生物生长良好后覆盖2-3mm无菌液体石蜡.石蜡可防止培养基失水又隔绝氧气,降低代谢.但不适用于可以石蜡为碳源的微生物.

砂土管干燥保藏法 方法：将干燥砂粒与细土混合后灭菌制成砂土 管，然后接种保藏。 原理：无营养，缺氧，干燥 方法：将干燥砂粒与细土混合后灭菌制成砂土 管，然后接种保藏。 原理：无营养，缺氧，干燥 适用：产孢子的丝状真菌、放线菌；有芽孢的细菌 保藏期：2-10年或更长

步骤： 沙： 土：取地面下40～60cm非耕作层贫瘠且粘性较小的土，研碎，100目过筛， 60目筛 80目筛 河沙 吸铁石 弃去大颗粒及杂质 去掉细沙 10％～20％的 盐酸浸泡24h 吸去铁质 去除有机物 水洗至中性 烘干或晒干 土：取地面下40～60cm非耕作层贫瘠且粘性较小的土，研碎，100目过筛， 水洗至中性，烘干。 将处理后的沙、土按质量比2∶1混合。混匀的沙土分装入安瓿管或小试管中，高度为1cm左右，塞好棉塞，121℃高压间歇灭菌2-3次，烘干备用。 孢子或芽孢悬液 → 加入无菌砂土管中→ 干燥→ 封口 → 4-6℃保藏

沙土管恢复培养 无菌条件下打开沙土管，取部分沙土粒于适宜的斜面培养基上，长出菌落后再转接一次。或取沙土粒于适宜的液体培养基中，增殖培养后再转接斜面。

真空冷冻干燥保藏法： 方法：菌种培养 → 用保护剂悬浮→ 加入安醅管中→低温冻结（-25— -40℃）→ 抽真空→ 真空封口 → 4-5℃保藏 措施：低温、干燥，缺氧，保护剂 适用：各大类 保藏期：5-10年或更长

步骤 1安瓿管的处理 直径8-10mm，长度不小于100mm，洗净高压灭菌备用。 2 保护剂 低分子和高分子化合物，如氨基酸、糖类、蛋白质等。常用的是脱脂奶和血清。 3 菌悬液制备 最适培养条件、生长后期。产孢子的微生物须适当延长培养时间以获得成熟的孢子。 4 冷冻干燥 5 安瓿管的保藏 4-5℃保藏

复苏方法： —— 先用70%酒精棉花擦拭安瓿上部， —— 将安瓿管顶部烧热， —— 先用70%酒精棉花擦拭安瓿上部， —— 将安瓿管顶部烧热， —— 用无菌棉签沾冷水，在顶部擦一圈，顶部出现裂纹，用挫刀或镊子颈部轻叩一下，敲下已开裂的安瓿管的顶端， —— 用无菌水或培养液溶解菌块，使用无菌吸管移入新鲜培养基上，进行适温培养。

液氮超低温保藏法 方法：菌悬液 → 加入保护剂 → 分装至安醅管中（0.2-1cm菌悬液）→逐步降温至-25℃→液氮罐（-196℃）保藏 措施：低温、加保护剂（10%甘油） 适用：范围广泛 保藏期： 一般2～3年，长则9年。

菌种的准备可采用下列几种方法： 刮取培养物斜面上的孢子或菌体，与保护剂混匀后加入冻存管内； 接种液体培养基，振荡培养后取菌悬液与保护剂混合分装于冻存管内； 将培养物在平皿培养，形成菌落后，用无菌打孔器从平板上切取一些大小均匀的小块（直径约5-10毫米），真菌最好取菌落边缘的菌块，与保护剂混匀后加入冻存管内； 在小安瓿管中装1.2-2毫升的琼脂培养基，接种菌种，培养2-10天后，加入保护剂，待保藏。

复苏方法： 　　从液氮罐中取出安瓿管或塑料冻存管，应立即放置在38℃-40℃水浴中快速复苏并适当摇动。直到内部结冰全部溶解为止，一般约需50秒-100秒。开启安瓿管或塑料冻存管，将内容物移至适宜的培养基上进行培养。

菌种冻存管

四、菌种保藏的注意事项 菌种在保藏前所处的状态：孢子或芽孢 菌种保藏所用的基质：碳源 操作过程对细胞结构的损害

7种常用菌种保藏方法的比较 方法 主要措施 适宜菌种 保藏期 评价 斜面低温保藏法 低温（4℃） 各大类 约1～6月 简便 冰箱保藏法 （半固体） 低温（4℃），避氧 细菌，酵母菌 约6～12月 液体石蜡封藏法 低温（4℃），阻氧 约1～2年 砂土干燥保藏法 干燥，无营养 产孢子的微生物 约1～10年 简便有效 甘油悬液保藏法 低温（－70℃），保护剂（15～50％甘油） 约10年 较简便 冷冻干燥保藏法 干燥、低温、无氧，有保护剂 >5~15年 繁而高效 液氮保藏法 超低温（－196℃），有保护剂 >15年

菌种保藏机构 Ex： 美国的标准菌种保藏所（ATCC） 美国农业部农业研究服务部（ARS） 英国国立标准菌种保藏所（NCTC） 我国：1 普通微生物菌种保藏管理中心（CCGMC） 2 农业微生物菌种保藏管理中心（ACCC） 3 工业微生物菌种保藏管理中心（CICC） 4 医学微生物菌种保藏管理中心（CMCC） 5 抗生素菌种保藏管理中心（CACC） 6 兽医微生物菌种保藏管理中心 （CVCC）