南京农业大学动物科技学院曲亮 敬向与会专家、领导、企业家致意！

mRNA差异显示技术（DD）及其对动物育种的作用 曲亮 黄瑞华* 邱新深 刘红林 王林云 (南京农业大学动物科技学院，南京，210095) 基金项目：江苏省高技术研究项目（BG2005304）

DD的发明及其基础 由Liang于1992年创立 基于RT-PCR理论，依赖于3种技术 是分离差异表达基因强有力的工具 3）DNA电泳技术

DD的原理

M’N’AAAAAAAAAAAA(A)n 3’ Poly(A) RNA 5’ T12MN(M为A、G、C，N为A、T、G、C) 锚定引物 逆转录 启动cDNA第一链合成 5’ M’N’AAAAAAAAAAAA(A)n 3’ M N TTTTTTTTTTTT 5’ 3‘ 变性 5’ M’N’AAAAAAAAAAAA(A)n 3’ M N TTTTTTTTTTTT 5’ 3‘ 5‘ T12MN 3’锚定引物 寡核苷酸随机引物 退火 随机结合到cDNA链上 M N TTTTTTTTTTTT 5’ 3‘ 不同长度的PCR产物 dNTP、Taq聚合酶 延长 M N TTTTTTTTTTTT 5’ 3‘ M’N’AAAAAAAAAAA 3’ 5’ 变性、退火、延伸 电泳 显示 回收差异条带，再扩增，克隆测序，同源比对

DD目前的应用领域 主要用于医学研究的癌症、神经、骨科、病理、生殖等领域 动植物遗传、育种，动物营养及微生物等领域

DD的优点 以RT-PCR和DNA凝胶电泳为基础 灵敏度高，仅需0.2μg的总RNA 可以同时比较多个样品间基因表达的差异 可以同时检测到“上调”及“下调”的基因 时间短，实验过程中可步步验证比较 可进行多基因家族的表达分析

DD的缺点 假阳性高 绝大多数差异条带仅含有3’-UTR 500bp以内的一短片段的信息，这些区域的序列结构相对保守，得不到特异的基因 样品mRNA可能有部分降解 有少量的DNA污染 单条带可能由一种以上cDNA 片段所构成 有些特异cDNA片段太短,在Northern杂交时检测不到杂交信号 PCR扩增了一些稀有mRNA片段,在杂交时显示不出差异表达的信号 绝大多数差异条带仅含有3’-UTR 500bp以内的一短片段的信息，这些区域的序列结构相对保守，得不到特异的基因 对低丰度mRNA检出率低

DD技术改进 针对以上不足,特别是假阳性率高的缺点，从以下几个方面做了大量改进： 引物设计 反应条件的优化 显示方法 假阳性鉴定

DD在动物育种中的应用 比较不同品种间的差异 寻找数量性状QTL侯选基因 研究杂种优势机制 比较世代间的差异

DD在现代动物育种中的应用展望 目前主要致力于两个品种或组合间比较 我们在苏淮白猪选育中的应用思路： 分析新品系内不同优点的家系或类型间的遗传相关 检测新品系猪与其它品种猪的遗传距离

衷心感谢各位与会者 敬请批评指正！

引物设计 mol等将12种锚定引物变为4种，并发现G的扩增效果最好 王夏等在T12MN之前加上了一段T7启动子序列，提高了PCR反应的严谨性 Liang发现9~10个mer长度的随机引物比较适宜 Liang还发现，当长度为13bp，在5’端增加HindⅢ酶切位点，能更有效的扩增，并能提高特异性

反应条件优化 RNA模板量在2-3μg时，能扩增出较多的条带 不同条件下dNTP浓度不是固定不变的 1.5-2.0mmol/L的Mg2+浓度效果较好 40-42℃的退火温度通常能得到较好的扩增效果，周宁新等在PCR的头两个循环，用低严谨的退火温度36℃，在随后的循环中退火温度提高到45℃，获得了很清晰的电泳图谱

显示方法 最初DDRT-PCR通过放射性同位素在变性胶上进行放射自显影成像 Sanguinetti介绍了一个快速银染方法，只需15分钟，而且容易克隆回收 Rompf等通过琼脂糖凝胶电泳分辨差异cDNA片段 余桂华等建立了荧光mRNA差异显示方法，最大限度地降低了假阳性

假阳性的鉴定 Northern blot仍是鉴定差异的一个主要手段；分析较多条带，反向Northern blot是较为切合实际的选择 Heinz通过SSCP分析排除了非差异表达的cDNA污染 Callard把纯化后的PCR 产物分成两部分:一部分用于克隆，另一部分用作探针杂交以筛选克隆 Sompayra设计了向5’步移的方法

比较不同品种间的差异 Pan等应用DD寻找杜洛克和二花脸猪背最长肌中差异表达的mRNA，对10条差异表达cDNA克隆、测序，有6条cDNA显示与GenBank上已鉴定的基因类似，另外4条是未知基因

寻找数量性状QTL侯选基因 Janzen等用DD分离的差异表达cDNA 片段与猪ARPP-16转录物的3‘末端一致，试验组猪ARPP-16的表达量比对照组高4倍,提示猪ARPP-16基因可能在猪肌肉生长中起重要作用 S.Ponsuksili应用DD方法寻找猪眼肌面积的可能侯选ESTs，构建4个RNA池，显示了27条非共有条带，有2个克隆显示与已知基因有高同源性，2个克隆与EST序列相似 M.D.Li等应用DD方法发现梅山猪的TSH-β基因过量表达，大约为成年WC猪的3倍，推测β亚基的过量表达很可能是梅山猪比白猪合成系性成熟早的原因

研究杂种优势机制 Y G Liu应用DD技术研究两个杂交组合背最长肌中基因表达的差异，观测到8个不同的典型表达模式，相关性分析表明，大白、梅山正反杂交组合与母体效应有关，而在大白、长白杂交组合中，父本效应在杂种的基因表达中起作用，或基因表达偏向于某一亲本 Liu(2005)等在研究大白和长白杂交组合背最长肌中基因表达的差异时，发现了一个猪的新基因，命名为猪的CA-Ⅲ基因，他催化可逆的二氧化碳水合作用，但还不确定与杂种优势是否相关

比较世代间的差异 Ren等研究了梅山猪和大白猪及其正反F1代杂种猪背部皮下脂肪组织间的基因表达情况，4 条 EST 分别与 GenBank 序列同源性较高，其余36条EST在亲子代之间的差异表达方式不尽相同