基因异常与疾病 中国医科大学医学遗传教研室 主讲：孙秀菊

第七节 肿瘤遗传学 Cancer（Tumor）Genetics

主要内容 一 、肿瘤发生的环境因素 二、 肿瘤发生的遗传因素 三、 肿瘤的细胞学基础 四、 肿瘤的分子基础 五、肿瘤发生的遗传学说

肿瘤：一群生长失去正常调控的细胞形成的新生物（neoplasm）。 肿瘤分为：良性和恶性肿瘤 恶性肿瘤 85%为癌(carcinoma) 2%为肉瘤(sarcoma) 5%为淋巴瘤(lymphoma) 3%为白血病(leukemia)

肿瘤的发生是多因素、多基因、多阶段、多途径的 肿瘤遗传学（Cancer Genetics) 应用遗传学的基本原理、方法，从遗传 方式、遗传流行病学、细胞遗传和分子遗传 学等不同的角度探讨肿瘤发生与遗传的关 系，从而探讨肿瘤防治新途径的一门多学科 渗透的新兴学科。 肿瘤的发生是多因素、多基因、多阶段、多途径的

一 、肿瘤发生的环境因素

化学：亚硝胺，黄曲霉素等 物理：电离辐射，紫外线等 生物：病毒等 不良生活习惯：烟草和酒精等

二、肿瘤发生的遗传因素

1 家族聚集性 癌家族（Cancer family） 一个家系在几代中多个成员发生同一器官或不同器官的恶性肿瘤。 特点： 1.肿瘤发生率高； 2.某种肿瘤（腺癌、肉瘤）发病率高； 3.肿瘤有多发性（部位）； 4.发病年龄早； 5.符合常染色体显性遗传特点。

代表性的癌家族综合征： 如： Lynch癌家族综合征 Li-Fraumeni综合征

Lynch癌家族综合征部分系谱图（引自：李璞，医学遗传学，2000） 经几十年研究调查：该家族7代的842名成员，有95名患癌，同一患者可以有不同器官的癌。所患的癌以结肠癌为主，子宫内膜癌比较常见，还有胃癌，卵巢癌，胰腺癌，乳腺癌等。

Li-Fraumeni综合征（LFS） （引自：李璞，医学遗传学，2000） 以乳腺癌为主的癌家族综合征，呈AD， 也可发生脑瘤，骨肉瘤，横纹肌肉瘤，白血病，肺癌，肾上腺皮质癌等。

家族性癌（familial carcinoma） 一个家族内多个成员患同一类型的肿瘤,该家族成员对此类型肿瘤的遗传易感性增高。 同卵双生子发病一致率研究 对白血病患者双生子调查: 同卵双生子发病一致率高 遗传因素

2 肿瘤发生率的种族差异 不同种族中某些肿瘤发病率有明显差异 例如：中国人鼻咽癌发病率较高, 移居到美国的华人比美国人高34倍。 日本人松果体瘤患病率比其他民族高十余倍。 ——种族差异主要是遗传差异所致，在肿瘤发生中也起作用。

3、染色体不稳定综合征 共同特征： AR， DNA修复系统异常 ，所以染色体DNA不稳定，易于发生断裂或重排，易患白血病或其他恶性肿瘤。 Bloom’s 综合征 Fanconi 贫血 毛细血管扩张性共济失调 着色性干皮病 它们各自的特点请参阅教材

4、遗传性癌前病变 一些单基因遗传的疾病和综合征中，有不同程度的患恶性肿瘤倾向，称为癌前病变。其遗传方式大部分为常染色体显性。

1).家族性结肠息肉综合征 遗传方式: AD 特征:病变局限于结肠和直肠，息肉为腺瘤性，数 目可多可少，十几岁时即可能开始恶变为腺癌，40岁前多恶变为癌。 致病基因APC位于5q21-q22，是一种抑癌基因，在APC基因有杂合性缺失基础上，又经癌基因KRAS2、抑癌基因DCC、Tp53等多步变化，才形成结肠腺癌。

2).神经纤维瘤 遗传方式:AD 临床特征:患者的皮肤有牛奶咖啡斑和纤维瘤样皮肤瘤，如有6个以上直径超过1.5cm的牛奶咖啡斑可诊断为该病。 3%～15%可恶变为纤维肉瘤、鳞癌和神经纤维肉瘤。 致病基因: NF位于11q11.2，是一种抑癌基因，其产物可特异抑制RAS癌基因

3).基底细胞痣综合征 遗传方式:常染色体显性遗传 特征： 患者面部、手臂和躯干有多数基底细胞 痣，青春期增多。 特征： 患者面部、手臂和躯干有多数基底细胞 痣，青春期增多。 青年期即可发生恶变，40岁时90%恶变为基底细胞癌，并有颌骨囊肿。 致病基因BCNS位于9q22.3-q31，是一种抑癌基因。

5、遗传性肿瘤 少数来源于神经或胚胎组织的肿瘤常为遗传性肿瘤； 这些肿瘤按常染色体显性遗传方式遗传，常为双侧性或多发性，发病早于散发型病例； 遗传性肿瘤虽然少见，但在肿瘤病因学研究上有重要意义。

1)视网膜母细胞瘤（Retinoblastoma，RB) 儿童期（多在4岁以前）发病的一种眼内的恶性 肿瘤,发生率约1/21000～1/10000 临床表现：早期为眼底灰白色肿块，多无自觉症 状，以后肿瘤长入玻璃体，使瞳孔呈黄色光反射 时，才容易被发现，称为“猫眼”。 遗传型多为双侧发病，发病早，有家族 史。 非遗传型多为单侧发病，且在2岁以后才 发病。

2)其他：肾母细胞瘤（ Wilms瘤，WT)，神经母细胞瘤（ Neuroblatoma，NB)等。也具有遗传型和非遗传型（散发型）两种类型。

6、肿瘤的遗传易感性 肿瘤的遗传易感性最明显的临床特征：家族史 例如： 乳腺癌 两个易感基因BRCA1和BRCA2 二者突变的妇女 肿瘤的遗传易感性：具有某些遗传缺陷或某种基因多态性变异型的个体容易发生肿瘤的特性。 肿瘤的遗传易感性最明显的临床特征：家族史 例如： 乳腺癌 两个易感基因BRCA1和BRCA2 二者突变的妇女 乳腺癌：60％－90％ 卵巢癌：20％－60％

三、 肿瘤的细胞学基础 －－－染色体异常与肿瘤 三、 肿瘤的细胞学基础 －－－染色体异常与肿瘤 1 肿瘤染色体数目异常 2 肿瘤染色体结构异常

1 肿瘤染色体数目异常 肿瘤细胞染色体大多数为非整倍体，实体瘤染色体数目多在二倍体左右，或在三、四倍体之间； 1 肿瘤染色体数目异常 肿瘤细胞染色体大多数为非整倍体，实体瘤染色体数目多在二倍体左右，或在三、四倍体之间； 胸、腹水中转移的癌细胞染色体数目变化较大，可见到六倍体、八倍体等。 但是，染色体数目变化较小的癌细胞并不意味其恶性度低。

2 肿瘤染色体结构异常 染色体断裂、重排形成的结构异常的染色体.若经常出现于某一种肿瘤细胞中，则称之为标记染色体。 染色体结构异常——易位、缺失，引起癌基因的激活和抑癌基因的失活，这是癌症发生的重要分子基础。

1） Ph 染色体 1960年首先在美国费城的慢性粒细胞白血病（CML）患者骨髓和外周血淋巴细胞中，发现一个很小的近端着丝粒染色体，小于G组染色体。被称为Ph染色体。 原因： t（9；22）（q34；q11）易位 结果导致9q+和22q-（ Ph） (引自 Gelehrter et al,1998)

临床意义： （1）.作为CML诊断依据，约95%的CML病例中存 在Ph染色体； （2）.用于预后判断—— Ph阴性CML对治疗反 应差，预后不佳； （3）.用于早期诊断—— Ph染色体先于临床症 状出现。

2） 14q+染色体: Burkitt淋巴瘤（BL）患者的特异性标记 染色体，在75%的BL患者中存在。 t（8；14）（q24；q32） 8q- 和14q+

四 肿瘤的分子基础 癌基因和肿瘤抑制基因

1 癌基因 1）、癌基因和原癌基因的概念 癌基因（oncogene）：能够使细胞无限增殖和发生恶性转化的一类基因称为癌基因。 原癌基因（proto-oncogene）：指正常细胞内存在的与癌基因具有同源序列的基因, 具有使细胞发生癌变的潜能。其正常时参与细胞生长分化的调节,异常改变将引起细胞无限增殖和恶性转化。

2 ）癌基因的功能分类 依其编码产物（分布于细胞的不同部位）功能分 类： 1 生长因子： sis 、PDGF等 2 生长因子受体： erbB1，EGFR等 3 信号传递因子：src、Ras等 4 核转录因子： myc， fos， jun等。 5 细胞周期素、CDK网络成分和激酶抑制子

3）原癌基因的激活机制 细胞中原癌基因可以通过一些机制被激活,导致基 因表达或过表达,从而使细胞癌变,一般分为4类: 1）基因扩增： 原癌基因的DNA序列扩增使其拷贝数大量增加， 从而激活并导致细胞恶性转化。 在儿童较常见的一种神经母细胞瘤中可以见到N-MYC基因特征性的扩增，且N-MYC基因的扩增与预后不良有关。

2）启动子插入： 原癌基因附近被插入一个强大的启动子，如逆转录病毒基因组中的长末端重复序列（LTR）时，可被激活。

3）点突变：原癌基因中由于单个碱基突变而改变了编码蛋白质的功能使原癌基因激活。K-ras N-ras， H-ras，12、13、61 密码子突变 (引自 Gelehrter et al,1998)

4）染色体易位或重排：染色体易位与重排导致原癌基因在染色体上的位置发生改变，使其易位到一个强大的启动子、增强子或转录调节元件附近而表达增强，或由于易位与其他基因形成融合基因，因而被激活。

2 肿瘤抑制基因 （Tumor Suppressor Gene ，TSG） 正常细胞中存在的一类调节细胞生长、增殖和分化，具有抑制肿瘤细胞增殖作用的基因。 目前已发现30多种TSG，如RB1，p53，P16，p21,p27, APC，VHL ,WT1，MCC，DCC，BRCA1，BRCA2等 。

五、肿瘤发生的遗传学说

1.肿瘤单克隆起源学说 该学说认为肿瘤是由同一突变细胞，经分裂、增 殖而形成克隆。但受各种因素影响，克隆起源的 癌细胞核型有不同变化，呈克隆演化。 在肿瘤细胞群体中，占主导地位的克隆- 干系 干系的染色体数目称为众数。 非主导克隆--- 旁系

2.二次打击学说 1971年Knudson为解释家族性(遗传型)视网膜母细胞瘤提出二次打击学说(two hits theory)： 恶性肿瘤的发生需经两次或两次以上的突变。遗传性病例中，第一次突变发生于生殖细胞，结果个体每一个体细胞均带有一个突变，成为突变的杂合子。

在此基础上发生的第二次突变是体细胞突变。两次突变相加，即可完成始动（initiation)，而从良性细胞变成恶性细胞。恶性细胞在一定条件下，形成增殖优势，即可完成促进阶段,形成恶性细胞克隆。因此，遗传型病例常为双侧或多发且发病较早。

在非遗传性病例中，两次突变都是体细胞突 变，而且必须在同一个体细胞中先后两次发生 突变才能完成始动过程。这种机会比较少，需 要经过漫长过程的积累。故非遗传性肿瘤多为 单侧发病、单发，且发病较晚。

(引自 Gelehrter et al,1998)

3.肿瘤发生的多基因 、多因素、多途径、多阶段学说 癌是体细胞遗传病 癌发生涉及多个基因的变化：如癌基因、抑癌基 因和错配修复基因等； ——癌是多基因病 癌的发生与常见的复杂性疾病一样，也是由遗传 因素和环境相互作用的结果 —— 癌是多因素病

癌的遗传事件不是单一而是多途径如基因突变、DNA甲基化、组蛋白乙酰化等。 —— 癌是多途径机制 癌的发生经历基因多次突变或表观遗传学改变的累积，其发展是一个多阶段的过程。 —— 癌的发生、发展是是多阶段过程 ——早预防、早发现、早治疗

结肠癌发生的分子事件 (引自 Gelehrter et al,1998)

本节主要内容 染色体不稳定综合征的类型 Ph染色体和14q+染色体形成机制及意义 癌基因和原癌基因概念、癌基因功能分类、原癌基因激活机制 抑癌基因概念 二次突变学说 肿瘤发生的多基因、多途径、多阶段学说（以结肠癌为例）

第八节 遗传病的基因诊断

一、基因诊断技术 二、基因诊断的概念 及遗传多态性标记 三、基因诊断方法及实例 直接诊断 间接诊断

一、基因诊断技术 Southern印迹杂交 Northern印迹杂交 斑点杂交 荧光原位杂交 聚合酶链反应（ PCR） 多重PCR等 PCR-SSCP PCR-DGGE 等

二、基因诊断的概念及遗传性多态性标记 1、基因诊断(gene diagnosis)的概念： 利用分子生物学技术从DNA/RNA 水平 检测人类遗传性疾病的基因缺陷（分析特定 的基因型）,而达到诊断的目的，又称DNA分 析法。

2基因诊断的特征 1）.不受材料来源影响 外周血、活体穿刺组织、孕妇外周血、绒毛、羊水、血斑等. 2）.症状前诊断 尤其对于一些延迟显性疾病，如Huntington舞蹈病. 3）.产前诊断 避免患儿出生，提高人口质量. 4）.阐明遗传异质性 对相同或相似的遗传病进行分子水平的再分类.

3 DNA分析中常用的遗传性多态性标记 DNA多态（DNA Polymorphism）：

有3类： 1）限制性片段长度多态（RFLP）： 为第一代多态性标记； 2）可变数目的串联重复多态（VNTR）：如短串 联重复序列（STR），为第二代多态性标记； 3） 单核苷酸多态（SNP）：DNA序列的单个核苷 酸的差别，为第三代多态性标记。

1）限制性片段长度多态性 (Restriction Fragment Length Polymorphism ，RFLP) 由于碱基变异可能导致限制酶切点消失或新的酶切点出现，使群体中不同个体的DNA用同一限制酶切割时，产生不同长度的DNA片段，称 RFLP。 RFLP按孟德尔（共显性）方式遗传，是非常有用的遗传标记。

Allele I 和Allele II 的酶切位点不同 12Kb Allele I Allele II 8Kb 4Kb probe RFLP—Southern blot检测结果

2）数目变异串联重复，variable number tandem repeats, VNTR） 重复单位6~25bp长，称为小卫星DNA。 重复单位2~6bp长，如（TA）n, (CGG)n等，称为微卫星DNA。

VNTR两侧酶切位点固定，但两酶切点之间的串联重复拷贝数不同，酶切后产生不同长度的片段。 DNA多态也可以通过PCR扩增后电泳来检出，称扩增片段长度多态（amplified fragment length polymorphism, Amp-FLP）

VNTR 酶切，电泳后的检测结果 大 小

引自 孙开来等 人类发育与遗传学，2008

（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）

三、 基因诊断方法及实例 直接诊断——直接检测某一疾病相关基因是否存在异常而作出诊断。 间接诊断——应用基因内或基因近旁DNA多态 为遗传标记进行连锁分析，判断是否获得了带有致病基因的染色体而间接作出诊断。

1 直接基因诊断及实例 直接检测致病基因本身的异常。通常使用基因本身或邻近DNA序列作为探针，进行Southern 杂交，或通过PCR 扩增产物，以检测基因点突变、缺失、插入等异常及性质。主要适用于相关基因已知且异常性质也已知的疾病的诊断。

1）突变型遗传病的直接基因诊断 镰形细胞贫血的基因诊断 （1）Southern blot： β珠蛋白基因第6位密码子发生突变 GAG——GTG 谷Aa——缬Aa

已知限制酶MstⅡ识别序列 （CCTNAGG）, CCTGAGG CCTGTGG，突变后不能识别， 酶切位点消失，酶切片段长度发生变化。

（2) ASO探针诊断 已知突变基因部位和性质，合成寡核苷酸探针， 32P标记，进行斑点杂交。 Normal βΑGene Probe——与正常βΑ杂交稳定 Mutation βS Gene Probe——与异常βS杂交稳定

（Allele-specific-oligonucleotide ） 等位基因特异性寡核苷酸探针（ASO） （Allele-specific-oligonucleotide ）

突变型遗传病的直接基因诊断 斑点杂交结果： βΑ/βΑ βΑ/βS βS/βS 正常探针 突变探针

突变型遗传病的直接基因诊断

2）缺失型遗传病的直接基因诊断 DMD的基因诊断 DMD属XR DMD基因是最大的基因，有79个外显子 DMD基因突变主要以缺失为主，可涉及基因的不同部位 E1 E2 E3

缺失型遗传病的直接基因诊断 病例 1 2 3 4 5 6 7 8 bp 外显子 535 Pm 3 43 50 13 6 47 60 52 1 2 3 4 5 6 7 8 Pm 3 43 50 13 6 47 60 52 bp 535 113

2、间接基因诊断方法及实例 疾病基因本身尚未知时，或致病基因虽 然已知，但其异常性质未知时， 主要通过基因和DNA多态的连锁分析间接 地作出诊断。

连锁分析基于遗传标记与基因在染色体上连锁，通过对受检者及其家系进行连锁分析，分析子代获得某种遗传标记与疾病的关系，推断受检子代是否获得带有致病基因的染色体，间接地判断并做出诊断。 遗传标记是基因组中的DNA多态。 如：RFLP，VNTR 等。

间接基因诊断 遗传标记 相关基因 表型分析

1）Southern blot--RFLP诊断(PKU) PKU是由于PAH基因缺陷所致的AR，许多情况下PAH基因突变的部位和性质尚不明确，因此常采用间接诊断方法

Southern blot--RFLP诊断(PKU) PAH基因两侧有 Msp1酶切位点,用 该酶消化可产生 23kb、19kb 两 种等位片段，以 PAH cDNA为探针 与PKU家系成员外 周血DNA杂交。 引自 孙开来等 人类发育与遗传学，2008

患者为19kb片段的纯合子,说明患者缺陷的PAH基因与19kb片段连锁； 其父、母亲缺陷的PAH基因与19kb片段连锁，其23kb片段与正常PAH基因连锁； II2为23kb和19kb片段的杂合子，为表型正常的致病基因携带者。

2）甲型血友病诊断（PCR—RFLP） 已知甲型血友病是XR，是由于凝血因子Ⅷ因子基因遗传性缺陷所致，其突变部位和性质多数情况下不能明确，因此也采用间接诊断方法。 Ⅷ因子基因内含子18中含有限制酶Bcl1的多态位点，应用PCR技术扩增含该多态位点的片段，然后用Bcl1切割，可以得到不同的多态片段，据此进行间接诊断。

2）甲型血友病诊断（PCR—RFLP） 甲型血友病的基因诊断：已知甲型血友病XR，获得 家系成员基因组DNA 。 PCR 142 bp BcLI 142bp 99 bp 43bp 电泳 结果分析 p1 p2 142bp 99bp 43bp Bcl I Bcl I - Bcl I +

甲型血友病诊断（PCR—RFLP） 142bp 99bp 1 2 1 2 3 Ⅰ Ⅱ III

结果分析 1）先症者II 1具有99bp片段而发病，该片段来 自母亲。 2）II2有142bp/99bp，为杂合子。142bp来自父 为携带者。 3）Ⅲ1为99bp片段:如果是男性为患者（99bp片 段来自母亲）；女性为携带者（来自父母双 方）

基因诊断意义 现症病人的诊断：争取有效、针对性治疗。 产前诊断：意义更为重要，预防遗传病患儿的出生

本节主要内容 基因诊断概念 DNA多态 基因诊断方法及实例: 直接诊断（Southern blot） 间接诊断（PCR-RFLP）

谢 谢