血小板抗原、抗体检测和应用 广州血液中心 付涌水 血小板抗原、抗体检测和应用 广州血液中心 付涌水 2019/8/25

2018年广州地区采供血量 全血：53.11万单位（42.92万单位） 机采血小板：6.95万治疗量（6.67万治疗量） 手工分离血小板：101366U 2017年全国采血量： 4956吨 2019/8/25

血小板抗原 血小板相关抗原： 血小板特异性抗原 (HPA) : - 白细胞抗原（HLA系统,HLA-I）. - 红细胞抗原（血型系统,ABH、Lewis、I及P ）. -其它（CD36） 血小板特异性抗原 (HPA) : - 血小板表面膜糖蛋白Glycoprotein (GP). - 共鉴定出38个抗原. ABO, Le，P抗原 特异抗原又称人类血小板同种异型抗原HPA

HPA等位基因频率 European Bioinformatics Institute Database Primož Rožman, Transplant Immunology Volume 10; 2002, Pages 165-181

CD36 (GP IV)抗原缺失 Platelets: 亚洲人: 3-11% 北美: 2.5% 非洲: 7.8% 高加索人: 0.06% I 型: Absent from Platelets and Monocytes – 输血或怀孕存在免疫应答风险 II 型: Absent from Platelets only

亚太地区不同人群中CD36缺失I型 分布频率

检测技术

HPA和HLA分型 PLT抗体检测 HPA与HLA等位基因分型 特异性血清分型 HPA抗体 HLA抗体

1、HPA和HLA抗原基因分型技术 限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism， RFLP） 序列特异性寡核苷酸探针技术（Sequence Specific Oligonucleotide ,SSO） 序列特异引物PCR技术（PCR Sequence Specific Primer,PCR-SSP） DNA测序（SBT）

方法 PCR-SSP: 最简单常用，快速经济 PCR-RFLP: 繁琐，无法对HPA-4基因分型 PCR-ASO: 繁琐，不太容易判断结果 DNA序列分析法: 操作复杂，成本较高

2.抗体检测技术 ---同种、自身

HPA抗体检测技术 酶联免疫吸附实验（enzyme-linked immunosorbent assay ，ELISA）:MACE, PAKPLUS. 固相红细胞粘附实验（Solid Phase Red Blood Cell Adherence Assay，SPRCA）或混合细胞粘附实验（MRCA） 免疫荧光法：血小板免疫荧光试验（PIFT）、流式细胞仪分析法（F CA）和抗原包被珠子介导的Plt相关抗体检测法(Luminex screening assay) 单克隆抗体特异的血小板抗原固定试验 MAIPA

MACE, PIFT 和 MAIPA检测方法比较 应用 中国 欧洲 操作 简单步骤 没有特别的仪器要求 需要流式细胞仪 复习步骤 结果判读 Cut-off 值 HLA 抗体 影响HPA抗体的检测 很容易与HPA抗体区分 敏感性 对抗HPA-5, GPIV,HLA 抗体检测敏感性好; GPIIb/IIIa, GPIb/Ix 对 anti-HPA-5 and -15 antibody 检测敏感性低 对anti-HPA-5b 抗体检测敏感性高 特殊要求(如panel） 试剂已包被好 需要有已知特异性的血小板 漏检 CD109(HPA-15) 需要由panel决定，部分HLA抗体会漏检 自身抗体 可以 ---- 14 14

应 用 2019/8/25

血小板交叉配型 血小板输注无效的定义 产生原因： HPA特异性抗体：占8% 以PLT特异性糖蛋白抗体GPⅡb/Ⅲa抗体阳性为主，占HPA特异性抗体83.3%；经MAIPA PLT抗体特异性分析，50.0%患者存在抗HPA-3a抗体；33.3%患者HPA-3b抗体呈阳性，只有少量其他HPA抗体。 HLA抗体为主，64%; HLA-Ⅰ类抗体中，以抗HLA-A2、-A11及-B40最为常见； CD36抗体：占16% 自身抗体：12%

血小板输注无效 临床资料 MASPAT (交叉配型) 抗体特异性鉴定：抗HLA-class-I 抗HPA 药物性HPA抗体 自身抗体 PIFT HLA + HPA 基因分型

血小板交叉配型 CD36表达检测(流式法)； 抗体特异性筛查(ELISA法、MAIPA)； 交叉配型（固相凝集试验）。 HLAmatchmaker: HLA三级结构的相似性来执行HLA配对的策略； http://www.epitopes.net/ 优点：较容易获得配合的血小板；缩短配型时间 每输注10次血小板后，需再次监测病人有否产生抗体。 2019/8/25

建立HLA/HPA/CD36供者分型库 2019/8/25

CD36缺失供者库 2019/8/25

我国部分民族CD36在血小板上的缺失频率 2019/8/25 民族 CD36在血小板上的缺失频率 汉族 1.16% 满族 壮族 6.45% 3.30% 布依族 3.57% 畲族 彝族 1.88% 1.72% 穿青族 苗族 1.62% 0.89% 2019/8/25

CD36缺失患者的输血 输什么样的血液：I型缺失还是II型缺失； 2019/8/25

疾病的诊断 1. 新生儿同种异体免疫性血小板减少症(FNAIT） 2.血小板输注无效(RTP） 3.输血后紫癜（ PTP） 4.自身免疫性血小板减少症(AITP） 5.输血相关急性肺损伤（TRALI）

FNAIT动物模型 2019/8/25

TRALI的小鼠模型 2019/8/25

不同组小鼠的PO2检测结果 2019/8/25

不同组小鼠的SO2检测结果 2019/8/25

支气管-肺泡灌洗液蛋白浓度检测结果 2019/8/25

小鼠肺湿/干重比及外部形态 2019/8/25

GPIV抗体引起的FNAIT 病例 黎 **， 女， 37岁， 广西壮族，有反复流产史。血小板和单核细胞CD36表达流式检测：CD36 I型 缺失； （1）2009年，孕5月，胎死宫内，行引产术（第一次引产时输过血）； （2）2010年1月， 孕7月，发现胎儿腹水，行引产术； （3）2011年，孕5+月，发现死胎，鼻部畸形，行引产术； （4）2013年8月，死胎，胎儿水肿，行引产术； （5）？？ （6）2015年，孕8月，生育水肿胎儿 （7）2016年1月，孕3月， 向 ***， 黎 **丈夫，湖南汉族， 39岁， 血小板抗体检测阴性，血小板和单核细胞CD36表达均呈阳性。

胎儿血小板CD36流式检测结果 血小板CD36表达阳性： 一抗法Beckman 单抗：阴性， 一抗法4F9单抗：阳性 抗人IgG： 阳性 胎儿PLTs （来自脐血）直接与二抗（Goat anti-human-IgG：098）反应

患者抗体筛查结果 胎儿抗体筛查结果 -HLA class I ：POS -HLA class I ：NEG 患者抗体筛查结果 胎儿抗体筛查结果 -HLA class I ：POS -HLA class I ：NEG –GPIV （CD36抗体）：POS 不规则抗体筛查：阴性 Coombs：阴性 夫妻双方染色体核型：正常 血型：女方O，Rh（+）;男方A，Rh（+） 其他检查：SLE、风湿组合、D二聚体等无异常

脐血结果（治疗前） 分别于孕23周+3、孕27周+1行脐穿： Name antibody 患者胎儿 （23 weeks+3days） gestational age PLT (×109/L) WBC RBC (×1012/L) Hb (g/L) Hct 23 weeks+3days 192 2.31 2.07 84 0.251 27 weeks+1 days 18 3.6 0.95 43 0.132 患者胎儿 （23 weeks+3days） （27 weeks+1 days） -HLA class I 0.06 VS 0.123 0.088 VS 0.124 -GPIV（CD36） 0.425 VS 0.149 1.262 VS 0.13 Name antibody

临床检测结果：B超结果 B超结果 宫内妊娠，胎儿存活，胎儿发育相当于27+5孕周。 胎儿异常：NF增厚，心脏扩大：腹水。 大脑中动脉收缩峰值流速增高（>1.5MOM），考虑胎儿贫血。

临床治疗（30周+） 为纠正胎儿严重贫血和血小板低下， 宫内输注“O”型、CD36（-）红细胞（洗涤红细胞）：4次，0.5U/次

胎儿各阶段血常规 胎儿输血前血常规：Hb：39g/L，HCT：0.128，PLT：12X109/L

出生 31周+ 病人出院一周后，在顺德妇幼保健院，急产； 胎儿出生后，状态尚可.

第八次怀孕： 实验室检测： 超声检测（24周）：无水肿，但大脑中动脉仍升高（提示贫血）… 胎儿HPA抗体检测（26周+）：HPA-GPIV抗体阴性，但在流式检测表型的实验中观察到有抗体产生的趋势……预示激素治疗有效果，可延缓抗体产生？ 胎儿血常规检测24-27周： 临床治疗： 25周开始用强的松 27周+为了纠正贫血，宫内输注“O”型、CD36（-）红细胞（洗涤红细胞）：2次，0.5U/次 孕38周产下一健康男婴

谢谢大家！