METACASPASE4 (MC4)在Peps形成中的作用 曾敬萱 何子亭

背景介绍 昆虫啃食、动物践踏以及周边的不利环境都会造成植物的损伤，从而导致植物面临病原菌侵入的风险。损伤部位的植物细胞会释放出多种信号分子，激活周围组织中的防御反应，以对抗病原菌的侵入。这些信号分子被称为损伤相关的分子模式 (damage associated molecular patterns, DAMPs)，包括ATP、细胞壁衍生分子，小分子肽和谷氨酸。 在拟南芥中，植物激发子肽（plant elicitor peptides，Peps）是被认为一种DAMPs，可激活植物防御反应。拟南芥共有八个Peps，位于各自的前体蛋白（PROPEPs）的C末端。 前体蛋白水解后，Peps被两个类受体激酶PEPR1（PEP RECEPTOR 1）和PEPR2（LRR-RLKs）感知，随后，PEPRs与BAK1（BRI1-ASSOCIATED KINASE1）互作诱导先天免疫反应。研究发现，在两种PEPR缺失的情况下，植物防御能力会降低，对病原体和昆虫啃食敏感性增加。Peps作为植物免疫调节肽在很多植物中是保守的，然而Peps如何在植物受伤时产生和释放，以及这种反应从损伤部位能延伸到多远仍不清楚。

2019年3月22日，来自瑞士、比利时以及德国的联合研究团队 在Science发表了题为Damage on plants activates Ca2+- dependent metacaspases for release of immunomodulatory peptides的研究论文 揭示了植物受到损伤时，免疫调节肽的释放机制。该研究发现， 植物受到损伤时，半胱氨酸蛋白酶METACASPASE4（MC4） 对前体蛋白PROPEP的切割以及Peps的释放是必需的，并且 这个过程依赖于时空变化的Ca2+。研究结果或为作物抗病育种 提供新思路。

想法 在已有的研究基础上，对研究进行细化 研究在小麦中的机制 1.植物中高度保守的机制：钙离子---完整膜上的分配----蛋白酶使免疫调节肽成熟----防御 2.Peps作为伤口免疫调节肽在多种植物中保守，包括单子叶植物 3.被子植物都有propep metacaspase gene 已知番茄同源物的MC4切割propep 小麦机制尚不清楚，但小麦作为主要粮食作物，此研究对于其培育育种、调高抗病性等有重要作用…… 在已有的研究基础上，对研究进行细化 研究在小麦中的机制

01 02 03 STEPS 定性检测METACASPASE4对Peps的影响 验证METACASPASE4的直接作用是否为切割前体蛋白PROPEP为Pep 定量检测METACASPASE4对pep形成的影响

定性检测METACASPASE对Peps的影响 /01

定性检测METACASPASE4对pep的影响 文献方法： 在对植物损伤前10分钟用metacaspases抑制剂及一系列离子螯合剂和蛋白酶抑制剂浸润，然后将损伤部位进行琼脂糖凝胶电泳。

降低MC4的量对免疫的作用 方法一：检测植物受损时，体内MC4-GFP的活化情况，（需要用到激光成像、共聚焦成像，设备昂贵，因此只作为实验参考 文献1 、5） 方法二：酶抑制剂 用表达MC4-GFP和PROPEP-GFP的小麦幼苗 1.在损伤前10min，用METACASPASE4抑制剂渗透70%乙醇处理过的小麦幼苗 2.机械损伤 3.0-60秒每4秒一组；1-10min每1min一组；10-90min每5min一组，用液氮处理幼苗组织，去除细胞碎片及杂质，western blot检测pep/PROPEP含量，抗GFP抗体孵育，并应用Image Lab软件将实验结果量化 方法三：RNAi 1.通过GeneBank查找METACASPASE4的基因序列，使用siRNA进行干扰 2.（同方法二） 3.（同方法二）

预期结果： 1.方法一中MC4活化较多 2.两组实验组的pep含量与对照组相比很少或几乎没有，PROPEP则相反 是：继续实验 否：在损伤前用其他酶抑制剂或离子螯合剂进行类似实验，重新寻找小麦中切割Propep的酶（Plan B） /01

实验所得结果与之类似 箭头所指为实验组情况，其余为对照组情况 /01

体外检测METACAPASE4的直接作用 是否为切割PROPEP为pep /02

确定MC4的直接作用 1.获得纯化的MC4、PROPEP 方法一：GeneBank获得cDNA序列与载体重组，通过Gateway高效准确表达，体外合成获得高纯度蛋白 方法二：使目的蛋白带上His-TAG标签，通过亲和层析提纯 2.MC4的活化 在钙离子存在、pH7.5的情况下，加入提纯的MC4,结晶并与未加入钙离子的晶型对比，活化的MC有明显的构象变化 3.MC4是否直接切割PROPEP 在反应体系中加入活化的MC4和提纯的PROPEP进行反应，孵育一定时间后用含有50mM EGTA的Laemmli缓冲液终止反应，通过凝胶电泳进行检测 同时设置对照组，加入未活化的MC4 如果实验组出现较多的pep而PROPEP含量减少，则证明MC直接切割PROPEP 否则回到Plan B

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定量检测METACASPASE4对pep形成的影响 /03

定量检测METACASPASE4对pep形成的影响 . 定量检测METACASPASE4对pep形成的影响 实验目的：根据原文献，pep在体内积累过多可能是有害的 那么植物是如何控制体内活化的pep的量？ 设置多个实验组，一个对照组 对照组中只有一定量的PROPEP，实验组中MC4的量呈线性递增，PROPEP含量与对照组相同，反应一段时间后，检测pep的量。 可以用matlab软件拟合出符合数据规律的曲线

预期结果： 1.随着MC4量的增加，生成的pep量也增加，呈现正相关趋势 2.MC的量与pep生成的量类似于二次函数关系 3.MC4的量与Peps生成的量没有明显的规律或不符合上述两种规律 /03

结果解释： 1.植物中存在另一种机制，在pep超过一定量后抑制其部分作用 2.MC过高时会抑制pep的产生 3.如果证实MC4直接切割Propep产生成熟Peps，这种情况基本不会出现 如果出现结果2，能够更清晰地指导人工育种抗病性方面的靶向治疗手段 /03

参考文献： 1.T. Hander et al.,Damage on plants activates Ca2+-dependent metacaspases for release of immunomodulatory peptides.Science 363, eaar7486 (2019). DOI: 10.1126/science.aar7486 2. S. Bartels et al., The family of Peps and their precursors in Arabidopsis: Differential expression and localization but similar induction of pattern-triggered immune responses. J. Exp. Bot. 64, 5309–5321 (2013). doi: 10.1093/jxb/ert330; pmid: 24151300 3. A. Huffaker et al., Plant elicitor peptides are conserved signals regulating direct and indirect antiherbivore defense. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 5707–5712 (2013). doi: 10.1073/ pnas.1214668110; pmid: 23509266 /04

4. J. Schindelin et al., Fiji: An open-source platform for biologicalimage analysis. Nat. Methods 9, 676–682 (2012). doi: 10.1038/ nmeth.2019; pmid: 22743772 5. L. Tsiatsiani et al., Metacaspases. Cell Death Differ. 18, 1279–1288 (2011). doi: 10.1038/cdd.2011.66; pmid: 21597462 6. K. McLuskey et al., Crystal structure of a Trypanosoma brucei metacaspase. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 7469–7474 (2012). doi: 10.1073/pnas.1200885109; pmid: 22529389 7. D. Vercammen et al., Serpin1 of Arabidopsis thaliana is a suicide inhibitor for metacaspase 9. J. Mol. Biol. 364, 625–636 (2006). doi: 10.1016/j.jmb.2006.09.010; pmid: 1702801 /04

Thank you for listening