自身抗体检测及临床应用进展 北京协和医院风湿免疫科李永哲. 主要内容 自身抗体临床应用概况 疾病诊断和分类标准中自身抗体 新自身抗体在自身免疫病中临床应用 自身抗体检测新应用领域 自身抗体检测新方法新技术 自身抗体检测质量保证.

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1 自身抗体检测及临床应用进展 北京协和医院风湿免疫科李永哲

2 主要内容 自身抗体临床应用概况 疾病诊断和分类标准中自身抗体 新自身抗体在自身免疫病中临床应用 自身抗体检测新应用领域 自身抗体检测新方法新技术 自身抗体检测质量保证

3 自身抗体（ autoantibidies ） 自身抗体 : 指抗自身细胞内、细胞表面和细胞外抗 原成分的免疫球蛋白 原成分的免疫球蛋白 自身免疫应答和 AID 最重要特征 某些 AID 伴有特征性自身抗体 ( 谱 )

4 自身抗体临床意义 诊断 鉴别诊断 病情评估 治疗监测 病程转归 预后判断 预警、预防 个体化医疗 自身抗体 临床意义

5 自身抗体 相关性自身抗体 标记性自身抗体标记性自身抗体 生理性自身抗体生理性自身抗体非特异性自身抗体非特异性自身抗体特异性自身抗体特异性自身抗体 预警性自身抗体 自身抗体临床价值分 类

6 1948 : LEC 50 年代 :ATM(1956) 、 ANA(1957) IIF 60 年代 : anti-ENA,DID ;AMA,ASMA 70 年代 :IP,IB 80 年代 :HEP-2;ANCA 2000 年代 : 自动化、高通量 90 年代 : 商业化 40 年代： RF （ 1940 ） 自身抗体临床应用概况

7  国外临床常规自身抗体检测项目已达百种以上  系统性自身免疫病相关自身抗体 ANAs 、 ANCAs 、 APLs 、 RF ＆ ACPs ANAs 、 ANCAs 、 APLs 、 RF ＆ ACPs  器官特异性自身免疫病相关自身抗体 血液、消化、内分泌、神经、生殖、皮肤 … 血液、消化、内分泌、神经、生殖、皮肤 … 特发性血小板减少紫癜、自身免疫性肝病、炎症性肠病、自身免疫性胃炎 / 恶 特发性血小板减少紫癜、自身免疫性肝病、炎症性肠病、自身免疫性胃炎 / 恶 性贫血、麦胶性肠病、自身免疫性甲状腺炎、 1 型自身免疫性糖尿病、副肿瘤 性贫血、麦胶性肠病、自身免疫性甲状腺炎、 1 型自身免疫性糖尿病、副肿瘤 综合征、多发性神经病变、重症肌无力、不孕 / 不育和自身免疫性大疱病等 综合征、多发性神经病变、重症肌无力、不孕 / 不育和自身免疫性大疱病等  国内 : 临床常规项目少，普及性低，质量管理差 自身抗体临床检测及应用

8  临床应用：靶抗原特异性自身抗体 总抗体  特异性抗体 纯化、合成肽、重组抗原 总抗体  特异性抗体 纯化、合成肽、重组抗原  检测方法：标准化、多元化、自动化  检测质量：准确、快速，质量保证  应用临床 ：迅速，临床应用周期变短 自身抗体检测与临床应用进展

9 ANCAs anti-PR3 anti-MPO 总抗体检测 特异性抗体检测 提高临床应用价值 ASMAs anti- Factin AMA AMA-M2 anti- Sp100 anti- gp210 anti- p62 anti-LBR

10 国家卫生计生委关于印发医疗机构临床检验项目目录（ 2013 年版）的通知 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会 www.moh.gov.cn 2013-08-07 www.moh.gov.cn 国卫医发〔 2013 〕 9 号 各省、自治区、直辖市卫生厅局（卫生计生委），新疆生产建设兵团卫生局： 为适应医疗服务需要，提高临床检验水平，根据《医疗机构临床实验室管 理办法》（卫医发〔 2006 〕 73 号），我委组织专家对 2007 年公布的医疗机构临 床检验项目目录进行了修订，形成了《医疗机构临床检验项目目录（ 2013 年版 ）》（请在国家卫生计生委网站 “ 医政医管 ” 栏目下载）。现印发给你们，自即 日起执行，原卫生部印发的《医疗机构临床检验项目目录》（卫医发 〔 2007 〕 180 号）同时废止。 执行过程中遇到的问题请及时反馈我委医政医管局和卫生部临床检验中心 。 附件： 《医疗机构临床检验项目目录》（ 2013 年版）.xlsx 《医疗机构临床检验项目目录》（ 2013 年版）.xlsx 国家卫生计生委 2013 年 8 月 5 日 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会 临床准入 注册证、收费 自身抗体检测项目 154 项 1100 项

11 自身抗体检测项目比较 自身免疫病 ARUP 实验室克利夫兰实验室协和医院实验室 CTD （ SLE 、 MCTD 、 SS ） ANA ； dsDNA ； ENA ； C1q ；核小体；组蛋白 ANA ； dsDNA ； ENA ；组蛋白 ANA ； dsDNA ； ENA ； 核小体； C1q ；组蛋白 RACCP CCP ； AKA ； APF 、 MCV ； GPI ； α- 胞衬蛋白 SSc ANA ； ENA ； PM/SCL ； RNA polymerase I/III ； Th/To (7S/8S RNA) ANA ； ENAANA ； ENA ； Mi-2 ； Ku ； PM-Scl ； Jo-1 ； PL-7 ； PL-12 ； Ro-52 PM/DM Jo-1; 抗合成酶抗体： PL7, PL-12, EJ, OJ, KS, HA, Zo ; 非合成酶抗体： Mi-2, SRP, p155/140, HMGCR, MDA5, SA5, MJ; 肌炎相关抗体： PM-Scl, U1 RNP,U3 RNP, Ku, pLA, topo, RO, 5bKDa, hPMS1 ANA ； ENAANA ； ENA ； Mi-2 ； Ku ； PM-Scl ； Jo-1 ； PL-7 ； PL-12 ； Ro-52

12 主要内容 自身抗体临床应用概况 疾病诊断和分类标准中自身抗体 新自身抗体在自身免疫病中临床应用 自身抗体检测新应用领域 自身抗体检测新方法新技术 自身抗体检测质量保证

13 疾病自身抗体诊断和分类标准 系统性红斑狼疮 ANA, dsDNA, Sm, Ro, La, aCL 1997 ACR classification criteria 干燥综合征 Ro, La, RF, ANA2012 ACR classification criteria 类风湿关节炎 RF, ACPA 2010 ACR-EULAR classification criteria 系统性硬化症 Centromere, Topo-I, RNAP-III 2013 ACR-EULAR classification criteria 混合性结缔组织病 U1-RNP1996 diagnostic criteria 未分化结缔组织病 ANA 1997 preliminary classification criteria 抗磷脂综合征 LA, aCL, aβ2GPI 2006 consensus classification criteria ANCA 相关血管炎 ANCA, PR3, MPO 2007 consensus classification criteria SARD 诊断和分类标准中的自身抗体

14 1982 ACR1997 ACR2012 SLICC Immunologic abnormal2 items 6 items Positive anti-dsDNA, anti-Sm or antiphospholipid antibodies LE cell Positive anti-dsDNA, anti-Sm or antiphospholipid antibodies Positive ANA Positive anti-dsDNA Anti-Sm Antiphospholipid antibody Low complement (C3, C4 or CH50) Direct Coombs test in the absence of hemolytic anemia Diagnosis Satisfy 4 or more items Satisfy 4 items Classification Criteria for SLE Journal of Autoimmunity 48-49 (2014) 10-13

15 Immunologic criteria 1. ANA level above laboratory reference range 2. Anti-dsDNA antibody level above laboratory reference range (or 2-fold the reference range if tested by ELISA) 3. Anti-Sm: presence of antibody to Sm nuclear antigen 4. Antiphospholipid antibody positivity as determined by any of the following: Positive test result for lupus anticoagulant False-positive test result for rapid plasma reagin Medium- or high-titer anticardiolipin antibody level (IgA, IgG, or IgM) Positive test result for anti–2-glycoprotein I (IgA, IgG, or IgM) 5. Low complement Low C3 Low C4 Low CH50 6. Direct Coombs’ test in the absence of hemolytic anemia Derivation and Validation of the SLICC Classification Criteria for SLE ARTHRITIS & RHEUMATISM Vol. 64, No. 8, August 2012, pp 2677–2686 SLICC ＝ Systemic Lupus International Collaborating Clinics Anti-Nucleosomes antibodies ？ Anti-ribosomal RNP antibodies ？

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17 主要内容 自身抗体临床应用概况 疾病诊断和分类标准中自身抗体 新自身抗体在自身免疫病中临床应用 自身抗体检测新应用领域 自身抗体检测新方法新技术 自身抗体检测质量保证

18 疾病自身抗体临床意义 系统性红斑狼疮 (SLE) 抗载脂蛋白 -A-I 抗体、抗 HDL 抗体 狼疮并发心血管疾病和疾病活动 度相关 HEp-2 细胞高密度细颗粒荧光模式 (DFS) 或抗 DFS70 抗体 排除系统性自身免疫风湿病 类风湿关节炎 (RA) 抗氨基甲酰蛋白 (CarP) 抗体 抗瓜氨酸化蛋白抗体阴性的疑似 RA 患者诊断，与预后不良相关 抗肽酰基精氨酸脱亚氨酶 (PAD) 抗体 与侵蚀性关节炎相关，可能作为 PAD 抑制剂治疗的指征 炎症性肠病 (IBD) 抗胰腺酶原颗粒糖蛋白 (GP2) 抗体克罗恩病特异性标记物 麸质敏感性肠病 (CD) 抗去酰胺基麦角蛋白肽 (DGP) 抗体 IgG 抗组织转谷氨酰胺酶 (tTG) 抗体阳 性者确认；作为 IgA 缺乏的疑似 CD 患者血清学诊断依据； 2 岁以 下疑似 CD 患儿的诊断 特发性膜性肾病 (IMN) 抗磷脂酶 A2 受体 (PLA2R) 抗体 IMN 标志性抗体 自身免疫性脑炎 抗电压门控性钾离子通道 (VGKC) 抗体边缘性脑炎诊断血清学标记物 新的自身抗体的临床应用

19 特发性膜性肾病狼疮性肾炎肺 - 肾综合征血管炎性肾病 Anti-PLA 2 R Anti-C1q Anti-dsDNA Anti-nucleosome Anti-GBM Anti-PR3 Anti-MPO 自身免疫性肾病相关自身抗体谱

20 主要内容 自身抗体临床应用概况 疾病诊断和分类标准中自身抗体 新自身抗体在自身免疫病中临床应用 自身抗体检测新应用领域 自身抗体检测新方法新技术 自身抗体检测质量保证

21 Pathogenic Autoantibodies in SLE ) Rahman A., et al. NEJM, 24: 172 (2008 )

22 vvv 卵巢畸胎瘤 Anti-NMDAR 小细胞肺癌 Hu, Ri, CV2, VGCC, PCA-2, amphiphysin 乳腺癌 Yo, Ri, amphiphysin 胸腺瘤 GAD65, AChR, VGCC, CV2 卵巢肿瘤 Yo... 乳腺癌 肺癌 卵巢肿瘤 结直肠癌 B 细胞淋巴瘤 … Anti-RPC1 抗 NMDAR 脑炎副瘤综合症系统性硬化症与肿瘤 自身抗体检测在肿瘤疾病中应用

23 临床表现病例数发病率 (%) 深静脉血栓 38938.9 血小板减少 (<10 5 /μl) 29629.6 中风 19819.8 肺栓塞 14114.1 腿部浅表部位血栓性静脉炎 11711.7 心瓣膜疾病 11611.6 一过性脑缺血发作 11111.1 心肌梗死 555.5 Cervera, R., et al. Autoimmun Rev, 7: 174 (2008) 抗磷脂抗体与心血管疾病相关性

24 抗磷脂抗体与血栓性疾病 LA++---++ aCL+-++-+- aβ2-GPI+-+-+-+ Galli, M., et al. J Thromb Haemost, 8: 234 (2009) N=385 发病率

25 自身抗体预警价值 疾病前期 病程及预后 疾病预防﹑干预和早期诊断 病程演进过程和特定临床表现

26 N. Engl. J. Med N. Engl. J. Med., 349: 1526 (2003) ANA, aPL, anti-Ro, anti-La anti-dsDNA anti-Sm, antinuclear RNP SLE 诊断前后相关自身抗体的产生进程 SLE 任何症状前 9.4 年可检测到自身抗体 疾病预警

27 自身免疫病预测价值的自身抗体 Ann N Y Acad Sci 2006 Jun; 1069: 322-345.

28 主要内容 自身抗体临床应用概况 疾病诊断和分类标准中自身抗体 新自身抗体在自身免疫病中临床应用 自身抗体检测新应用领域 自身抗体检测新方法新技术 自身抗体检测质量保证

29 2012 年美国 CAP 报告显示   anti-ENA ： ELISA:46.3%(171/380) Multiplexed Bead:40.5%(154/380) ID:6.3%(24/380) Immunoblot:2.1%(8/380) Others:4.7%(18/380)  方法学选择：临床需求 与时俱进

30 自身抗体检测方法存在问题 定性 定量

31 自身抗体检测标准化﹑高通量﹑自动化

32 显微镜下实时荧光视频 双向音频对话 高清荧光图片 远程白板讨论 终端医院 中心医院全国网络 远程通信技术 智能影像技术 新电子技术 计算机多媒体技术

33 主要内容 自身抗体临床应用概况 疾病诊断和分类标准中自身抗体 新自身抗体在自身免疫病中临床应用 自身抗体检测新应用领域 自身抗体检测新方法新技术 自身抗体检测质量保证

34 自身抗体检测及临床应用存在问题 实验室检测 检测质量：定性，假阳性，假阴性，可比性差 检测项目：不能满足临床需求，过度检测，收费 临床应用 项目选择：规范性 报告解读：规范性

35 自身抗体检测的质量保证 vvv 检测中检测前检测后 适应症 患者的生理和病 理状况 样本信息 样本处理和储存 样本运输条件 检测误差范围 抗原特点 抗原包被 标准品 标准化操作 检测系统 检测结果的读取 测量单位 参考值 检测结果的解释 方法学的解释 待测自身抗体的分析有效性、临床有效性、临床实用性 临床医生产品供应商 检验医师

36 自身抗体检测质量管理策略

37 血常规﹑血沉 尿常规、沉渣、 24 小时尿蛋白 肝肾功能 补体、免疫球蛋白 ANA 、抗 dsDNA 、抗 ENA 、 ACL SLE 随访 血常规﹑血沉 尿常规、沉渣、 24 小时尿蛋白 肝肾功能 补体、免疫球蛋白 ANA 谱 、 ACL 、抗 B2GPI 、狼疮抗凝物 Coomb ‘ s 试验 SLE 初筛（全套） 血常规﹑血沉 尿常规、沉渣、 24 小时尿蛋白 肝肾功能 补体、免疫球蛋白、抗 dsDNA SLE 初筛（普通） SLE 检测项目选择 LN 尿常规、沉渣、 24 小时尿蛋白 补体 (C3 C4 C1q) 、免疫球蛋白 抗 dsDNA 抗核小体 抗 C1q

38 各种自身抗体检测方法优缺点 Diagn Pathol, 2009. 4 方法学局限性

39 N ENGL J MED 2009;360:711-20. IIF— 检测自身抗体的经典方法

40 自身抗体检测标准化 --ANA ARD 2014:73:17-23

41 自身抗体检测程序标准化 筛选试验？确认试验？ 2026 份临床连续送检血清标本 IIF-ANA 和 LIA-ANAs 的相互关系 2026 份临床连续送检血清标本 IIF-ANA 和 LIA-ANAs 的相互关系 风险 ANA ， ANCA, AMA,ASMA

42 质量控制 ( quanlity control, QC)   室内质控： 定值低水平／第三方质控品 ?   实验室比对：   室间质评：少 专业机构 : NCCL 2002 年 ANAs 140 家， 09 年 353 家， 2012 年 533 家 CAP NEQASs 专业学会 : 风湿病学会 2002 年 ANAs AMA/SMA anti-CCP 09 年 102 家 商业公司 : 商业公司 → 用户 自身抗体检测质量管理

43 自身抗体检测质控品自制 阴性质控品：特定项目人阴性血清混合物（若为 ELISA 或 CLIA 质控品浓度宜 0.5 倍临界值左右） 阳性质控品：特定项目人阳性血清混合物 弱阳性质控品： ELISA 、 CLIA ：临界值 1.5~4.0 倍的样本 IIF: 比临界值等于或高 1 个滴度 制备：留取 → 检测 → 处理（灭活、过滤） → 分装 → 评估（稳定性、瓶间差）

44 国内历年自身抗体诊断正确率 (%) 年度 ANAdsDNAENAAMAASMACCP 2002 年 47.070.046.095.040.0N/A 2003 年 85.082.037.067.050.0N/A 2004 年 86.075.063.010061.0N/A 2006 年 92.089.075.096.067.072.0 2008 年 70.088.072.093.085.079.0 2009 年 81.881.295.986.376.393.1 李丽君等, 中华检验医学杂志, 2012, 35: 265

45 2012 年全国自身抗体检测实验室比对检测结果

46 自身抗体检测结果解释  疾病标记（志）性自身抗体  疾病特异性自身抗体  疾病相关性自身抗体  疾病非特异性自身抗体  生理性自身抗体  疾病前期存在  检测方法及检测程序局限性  检测质量 : 假阴性﹑假阳性 解读困难

47 实验室：规范检测 方法 程序 质量管理 合理收费 定量 自动化 高通量 信息化 定量 自动化 高通量 信息化 临床应用：检测项目合理选择 ，报告正确解读 诊断 监测 预后 预警 个体化 诊断 监测 预后 预警 个体化 自身抗体规范检测及临床应用 规范检测 规范应用

48 北京协和医院风湿免疫科 李永哲 yongzhelipumch@126.com 谢 That’s all ， thank you.