血清测定 （改良赖氏法） 血清丙氨酸氨基转移酶活性测定 （改良赖氏法） 三峡大学医学院生物化学教研室 临床指标的检测.

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1 血清测定 （改良赖氏法） 血清丙氨酸氨基转移酶活性测定 （改良赖氏法） 三峡大学医学院生物化学教研室 临床指标的检测

2 1. 掌握血清丙氨酸氨基转移酶活性测定的基本 原理。 2. 熟悉血清丙氨酸氨基转移酶活性测定的具体 操作方法。 3. 了解血清丙氨酸氨基转移酶活性测定的临床 意义。 【目的要求】

3 临床意义 谷丙转氨酶 (Glutamic pyruvic Transaminase ， GPT) 丙氨酸氨基转移酶 (Alanine Transaminase ， ALT) ALT(GPT) 广泛存在于机体各种组织中，但在肝细胞中含 量最多，当肝脏有病变，特别是急性肝炎及肝细胞坏死，血 清中谷丙转氨酶活性显著升高。在肝癌、肝硬变以及胆道疾 病时，此酶活性也可中度或轻度增高。

4 正常人各组织 GOT 及 GPT 活性 ( 单位 / 克湿组织 ) 组织GPTGOT 肝44,000142,000 肾19,00091,000 心7,100156,000 骨骼肌4,80099,000 胰腺2,00028,000 脾1,20014,000 肺70010,000 血清1620

5 转氨酶是反映肝实质性损害的重要指标。 转氨酶是反映肝实质性损害的重要指标。 谷丙转氨酶（ GPT ）主要位于肝细胞浆内。 谷丙转氨酶（ GPT ）主要位于肝细胞浆内。 谷草转氨酶（ GOT ）则除胞浆外，也见于线粒体内。 谷草转氨酶（ GOT ）则除胞浆外，也见于线粒体内。 位于胞浆内的 GPT 较易逸出，故一般肝损害时， GPT 的升高 大于 GOT 的升高； 位于胞浆内的 GPT 较易逸出，故一般肝损害时， GPT 的升高 大于 GOT 的升高； 但在酒精性肝炎时，由于线粒体明显损伤， GOT 的升高明显 大于 GPT 的升高。但 GOT 的特异性 不如 GPT 。 但在酒精性肝炎时，由于线粒体明显损伤， GOT 的升高明显 大于 GPT 的升高。但 GOT 的特异性 不如 GPT 。 GOT/GPT 比值 可作为肝损害严重程度的指标， 轻度损害时比值小，严重损害时比值大。比值为 1.2 ～ 2.26 时，常为暴发性肝炎。 GOT/GPT 比值 可作为肝损害严重程度的指标， 轻度损害时比值小，严重损害时比值大。比值为 1.2 ～ 2.26 时，常为暴发性肝炎。

6 血清中的谷 - 丙转氨酶（ ALT ），在 37 ℃、 pH7.4 的 条件下，可催化基质（底物）液中的丙氨酸与 α- 酮 戊二酸生成谷氨酸和丙酮酸，然后测定丙酮酸的生 成量，即可计算酶活性的大小。 血清中的谷 - 丙转氨酶（ ALT ），在 37 ℃、 pH7.4 的 条件下，可催化基质（底物）液中的丙氨酸与 α- 酮 戊二酸生成谷氨酸和丙酮酸，然后测定丙酮酸的生 成量，即可计算酶活性的大小。 【实验原理】

7 生成的丙酮酸与 2,4- 二硝基苯肼作用，产生丙酮酸 2,4- 二硝基苯腙，后者在碱性环境中呈现红棕色。 生成的丙酮酸与 2,4- 二硝基苯肼作用，产生丙酮酸 2,4- 二硝基苯腙，后者在碱性环境中呈现红棕色。 颜色之深浅与丙酮酸含量成正比，与标准丙酮酸的 显色进行比较，即可测定丙酮酸的含量。 颜色之深浅与丙酮酸含量成正比，与标准丙酮酸的 显色进行比较，即可测定丙酮酸的含量。

8 不同的酶活测定方法 一般临床上用以测定 GPT 及 GOT 活性的方法有改 良的穆氏法、金氏法及赖氏法，这些方法都是基 于上述原理而设计的，操作也基本相同，只是这 些实验的某些条件、活性单位的规定和计算有所 差异。 一般临床上用以测定 GPT 及 GOT 活性的方法有改 良的穆氏法、金氏法及赖氏法，这些方法都是基 于上述原理而设计的，操作也基本相同，只是这 些实验的某些条件、活性单位的规定和计算有所 差异。 改良的穆氏法（ Mohun ）规定血清在 37 ℃ （ pH7.4 ）的条件下，与底物作用 30 分钟后，每 生成 2.5μg 丙酮酸为一个转氨酶活性单位。 改良的穆氏法（ Mohun ）规定血清在 37 ℃ （ pH7.4 ）的条件下，与底物作用 30 分钟后，每 生成 2.5μg 丙酮酸为一个转氨酶活性单位。 金氏法（ King ）则规定在同上条件下，与底物作 用 60 分钟后，每生成 1μM 丙酮酸为一个转氨酶活 性单位。 金氏法（ King ）则规定在同上条件下，与底物作 用 60 分钟后，每生成 1μM 丙酮酸为一个转氨酶活 性单位。

9 在紫外分光光度计中， 1ml 血清 ( 反应溶液总量为 3ml) 在 340nm 波长下，用内径为 1.0cm 的比色皿，在 25 ℃， 1 分钟内生成的丙酮酸，在乳酸脱氢酶催化下，使 NADH+H + 变成 NAD + ，使光密度下降 0.001 为 1 个转氨 酶活性单位。 卡门氏单位的定义为： 丙氨酸 + α- 酮戊二酸 谷氨酸 + 丙酮酸 GPT 乳酸脱氢酶 NAD + + 乳酸 NADH+H + NADH 在 260nm 和 340nm 处各 有一吸收峰，而 NAD + 只有 260nm 一处吸收峰，因此以 NADH 为辅酶的各种脱氢酶都可 通过 340nm 光吸收值的改变，定 量测定酶活力。

10 丙氨酸 + α- 酮戊二酸 谷氨酸 + 丙酮酸 GPT 乳酸脱氢酶 NAD + + 乳酸 NADH+H + 改良赖氏法 显色反应 分光光度法 赖氏法（ Reitman ）本身并未对转氨酶活性单位提出规定，他 是用卡门氏法（ Karman ）来定单位的。即用卡门氏法所测出的 单位数相当于赖氏法所产生的丙酮酸量的相关系数，套用卡门 氏单位而来。 由此可见，测定同一份血清的转氨酶活性，用不同方法测算， 其值不一样。因而它们的正常值范围也可有显著差异。 赖氏法 卡门氏法

11 试剂 ALT 底物液： α 酮戊二酸，丙氨酸 ALT 底物液： α 酮戊二酸，丙氨酸 pH7.4 磷酸缓冲液 pH7.4 磷酸缓冲液 丙酮酸标准液： 2μmol/ml 丙酮酸标准液： 2μmol/ml 2,4- 二硝基苯肼溶液 2,4- 二硝基苯肼溶液 0.4mol/L NaOH 0.4mol/L NaOH

12 01234 丙酮酸标准液 (ml) 0.000.050.100.150.20 ALT 底物试剂 (ml) 0.500.450.400.350.30 0.1M 磷酸盐缓冲液 pH7.4(ml) 0.10 2,4- 二硝基苯肼 0.5 混匀，置 37 ℃水浴 20 min 0.4mol/L NaOH5.0 相当于 GPT 活性 ( 卡门氏单位 ) 0.00285797150 实验操作 1. 标准曲线的制作 : 37 ℃， 5min 室温， 10min 以蒸馏水调零点，用 520nm 波长比色，读取各管吸光度

13 各管读数减去对照管 (O 管 ) 的光密度， 然后以光密度值为纵坐标，各管相应的转 氨酶活性单位为横坐标，绘制标准曲线。 实验操作 1. 标准曲线的制作 : （续）

14 TC 血 清 (ml) 0.1 — ALT 底物液 (ml) 0.5 混匀后，置 37 ℃水浴中保温 30 分钟 2 ， 4- 二硝基苯肼液 (ml) 0.5 混匀后，置 37 ℃水浴中保温 20 分钟 血 清 (ml) — 0.1 0.4mol/L NaOH(ml)5.0 2. 酶活性测定： 测定前将底物缓冲液在 37 ℃水浴中预温 5 分钟，再按下表操作。 混匀，室温中放置 10 min ，以蒸馏水调零点，用 520nm 波 长比色，读取吸光度。用 A T -A C 查标准曲线，即得到待测血清 中所含 ALT 的酶活性。 参考值： 5~25 卡门氏单位

15 实验结果 01234 A 520nm A n -A 0 卡门氏单位 0285797150 1. 标准曲线 2. 血清 ALT 活性TC A 520nm A T -A C ALT 活性 注：酶活性在 97 卡门 氏单位以下，标本经 稀释后与光密度值的 线性关系良好，酶作 用时间较短，更符合 酶测定要求。

16 注意事项 1 、不同血清对照管光密度基本相同，因此，同一批本只做 2-3 个血清对照管求其平均值即可。 2 、严重脂血症或黄疸、溶血的血清都能引起测定管 OD 值的增 加，因此，检测此类标本时，应作血清对照管。 3 、赖氏法标准曲线只到 97 卡门氏单位，其线性关系良好，超 过此活力的标本，应将血清稀释后再测定，结果乘以稀释倍 数。 4 、加入 2,4- 二硝基苯肼溶液后需充分振荡混匀，否则会影响 重复性。 5 、 ALT 底物液与 2,4- 二硝基苯肼液配制要准确。 6 、除了丙酮酸与 2,4- 二硝基苯肼在碱性溶液中能成腙外， α- 酮戊酸亦能与 2,4- 二硝基苯肼产生苯腙，两种苯腙的吸光度 在 520nm 处有较大差异，因此超过一定范围时，该方法所 绘制的标准曲线呈抛物线。

17 下周实验 血清蛋白质聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳 血清蛋白质聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳 制作 ppt 并发言 制作 ppt 并发言