开放性实验 溶菌酶对鸡胚尿囊膜血管发育抑制观察

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1 开放性实验 溶菌酶对鸡胚尿囊膜血管发育抑制观察
开放性实验 溶菌酶对鸡胚尿囊膜血管发育抑制观察 人体机能学试验中心 2017/2/26

2 血管生成抑制药物在临床肿瘤治疗中的意义 恶性肿瘤在全球范围内已成为常见病、多发病，据世界卫生组织报告，全球50多亿人口中，每年新诊断的肿瘤患者约为900万人，因肿瘤而死亡者达700万人，占总病死率的近20%。 传统的肿瘤治疗方法如手术、放疗和化疗虽有一定的进展，但都有它们本身的局限性。 多数肿瘤发现时已发生转移，超出了手术能切除的范围；放疗会损伤周围正常组织；化疗药物对正常细胞会产生毒副作用，且化疗还有耐药性问题。因此，上述疗法在大多数肿瘤中的疗效不能令人满意，寻找新的治疗方法成为治疗肿瘤的关键。 2017/2/26

3 2007年12月3日报道51岁的琼斯·迈斯特自青春期时起患上了一种罕见又恐怖的病：面部血管瘤。琼斯的血管瘤是由面部的毛细血管畸形引起的。从那时起，他的脸上开始生长硕大的肿瘤，如今已经蔓延到整个脸部，令他“面目全非”。经过近四十年的痛苦生活后，琼斯终于看到新的希望：将免费接受手术。 2017/2/26

4     上世纪70年代，美国科学家、哈佛大学医学院教授Judah　Folkman提出了著名的“饿死肿瘤疗法”，即通过阻断肿瘤新生血管生成，切断肿瘤营养供给，从而达到抑制和治疗癌症的目的，为癌症治疗指出了一条新的途径。 2017/2/26

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6 “饿死肿瘤”疗法的优点 与传统的肿瘤治疗方法相比，抗血管生成治疗具有高效性、特异性强、不易产生耐药性、毒副作用小和可治疗多种肿瘤等优点。
抗血管生成治疗是当今肿瘤生物靶向治疗领域的研究前沿和临床关注热点,是肿瘤控制治疗新策略的组成部分。 2017/2/26

7 2001年，中国医学科学院肿瘤医院联合全国24家临床医院，对恩度进行了近500例的大规模临床实验。2005年9月12日，恩度获得国家新药证书，成为拥有自主知识产权的国家一类新药。
孙燕教授，男，主任医师，博士生导师。1956年毕业于北京 协和医学院, 年间曾以客座教授身份在美国M.D.Anderson肿瘤中心从事研究。现任中国医学科学院、协和医科大学肿瘤医院临床药理机构和国家新药（抗肿瘤药）临床研究中心主任，亚洲临床肿瘤学会主席，中国癌症研究基金会副主席、中国抗癌学会临床肿瘤学协作中心（CSCO）指导委员会主任委员等。 罗永章：是清华大学生物科学与技术系教授 ，1962年6月出生于山东栖qixia霞。1985年毕业于兰州大学化学系，1987年赴美留学，1993年获美国加州大学伯克利分校博士学位。随后，先后在美国哈佛大学和斯坦福大学从事博士后研究。 2017/2/26 罗永章

8 海洋低温溶菌酶 Marine low-temperature lysozyme（MLTL）
通过生物发酵方法从一种海洋微生物中提取纯化 。20℃下将菌株振荡培养发酵40h，低温离心获取上清后经浓缩、透析、层析及色谱分别纯化后即可得到纯酶，相对分子量为39KD，纯度>98%。 海洋是一个多样化合物的世界，是开发新型药物的重要资源（Simmons，2005）。海洋抗肿瘤天然产物在海洋药物研究中一直占据主导地位。现已发现海洋生物提取物中至少10%具有细胞毒活性，美国每年有1500个海洋化合物单体被分离出来，其中1%具抗肿瘤作用。近10年来，抗肿瘤海洋药物研究在海洋药物研究中一直起着主导作用，目前科学家已从海绵、珊瑚、海苔虫、海兔等海洋生物中分离得到大量具有抗肿瘤活性的化合物，其中一些具有较高活性的化合物已进入临床前或临床试验阶段（Faulkner 2000；Shu 1998；姚新生 2002；蒋庆峰 2004；王正平 2004；吴久鸿 2002），但还未见具有抗血管生成作用的海洋药物用于临床试验的报道。 近年来，对海洋抗肿瘤药物的研究重点转向了海洋微生物，其在海洋环境里含量丰富且种类繁多，而且易于在人工条件下大量培养，因此可以克服采集和原料来源的困难（Amador，2003）。 抗肿瘤海洋微生物蛋白（MMOP）是我们课题组成员通过发酵方法从东海海泥中分离的一株海洋杆菌的代谢产物中分离纯化的一种新蛋白，已申请了专利保护。 2017/2/26

9 前期实验结果显示MLTL可抑制体外培养的牛主动脉内皮细胞增殖，在动物模型中抑制肿瘤生长和血管生成，但对体外培养的肿瘤细胞没有明显作用。这些结果表明MLTL有可能通过抗血管生成进而抑制肿瘤生长。
Superhuman, by Robert Winston and Lori Oliwenstein p. 126. 2017/2/26

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15 在体观察血管发育的模式生物 模式生物：通常指人们研究生命现象过程中长期、反复作为研究材料的物种，如，果蝇、线虫、斑马鱼、鸡胚、拟南芥等。人们在对这些物种的形态、解剖、生理、生化、细胞及遗传进行全面分析和归纳的基础上，把它们作为典范，将对其研究得出的规律，推演到相关的生物物种中，从而加快了对其他各种生物的研究。 2017/2/26

16 1933年摩尔根获得诺贝尔生理或医学奖 诺贝尔奖评选委员会将年2002年生理和医学奖授予了线虫生物学的开拓者：西德尼·布雷纳、约翰·萨尔斯顿和线虫凋亡之父罗伯特·霍维茨. 2017/2/26

17 模式生物的发展 早在20世纪最初的20年中，甚至更早到20世纪的 “上世纪”，人们就发现，如果把关注的焦点集中在相
对简单的生物上则发育的现象难题可以得到部分解答 （细胞数量更少，分布相对单一，变化也较好观察；由 于进化的原因，细胞生命在发育的基本模式方面具有相 当大的同一性）所以利用位于生物复杂性阶梯较低级位 置上的物种来研究发育共通规律是可能的。尤其是当在 有不同发育特点的生物中发现共同形态形成和变化特征 时，发育的普遍原理也就得以建立。因为对这些生物的 研究具有帮助我们理解生命世界一般规律的意义，所以 它们被称为“模式生物”。 2017/2/26

18 模式生物的特点 生理特征能够代表生物界的某一大类群 容易获得并易于在实验室中饲养繁殖 容易进行实验操作 2017/2/26

19 在体观察血管发育的模式生物 斑马鱼、鸡胚 斑马鱼作为模式生物的特点：
斑马鱼基因与人类基因的相似度达到87％，这意味着在其身上做药物实验所得到的结果在多数情况下也适用于人体，因此它受到生物学家的重视 ； 斑马鱼的胚胎是透明的，所以生物学家很容易观察到药物对其体内器官的影响 ; 雌性斑马鱼可产卵200枚，胚胎在24小时内就可发育成形，这使得生物学家可以在同一代鱼身上进行不同的实验，进而研究病理演化过程并找到病因 2017/2/26

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21 鸡胚绒毛尿囊膜模型 鸡胚的生物学构造 尿囊 卵黄囊 2017/2/26
鸡属卵生动物,胚胎在卵中发育。当卵子由葡萄状的卵巢排出时，正处于减数第二次分裂的中期阶段。然后卵子进入输卵管并下移，如果遇到精子，受到精子入卵的影响，即完成第二次减数分裂，放出第二极体并完成受精，所形成的合子在输卵管中还要经过２４－２７小时的发育。在如此长的时间内，合子已发育到了囊胚阶段甚至原肠胚早期阶段。此时的白色圆盘较大叫做胚盘。在进行上述发育过程的同时，鸡卵由输卵管前部逐渐后移，包上由输卵管分泌蛋白形成的卵白和壳膜，并在子宫内包上钙质壳后排到体外以实验部位边缘1 mm范围内为一级血管,实验部位边缘5 mm处为二级血管,对新生血管进行计数比较可用于促血管新生药物的评价和筛选。 鸡胚有4层胚膜(卵黄囊膜、羊膜、浆膜、尿囊膜)和2套血管网(卵黄囊血管网、尿囊膜浆膜血管网)。鸡胚尿囊出现在孵育的第3．5d，在孵育4～10d．尿囊腔迅速增大至胚外体腔并包围羊膜．以后尿囊外壁与绒毛膜紧贴形成尿囊绒毛膜 中胚层的双层结构由绒毛膜和尿囊膜组成．在这两层中形成丰富的血管网。不成熟的血管散在分布于中胚层．直到第8d形成毛细血管丛．覆盖在绒毛上皮细胞表面。毛细血管快速增殖持续到第11d．此后内皮细胞有丝分裂指数迅速下降．到第18d，血管系统最终形成。鸡胚孵化至第8d时．胚膜和血管网的发育已趋稳定，而机体免疫系统尚未完全建立．此时对各种异物几乎不产生排斥反应．便于观察各种诱导剂和抑制剂对血管生成的影响。 早期鸡胚的血液循环有3条主要路线，即卵黄囊血液循环、尿囊绒毛膜血液循环和胚内循环 。 2017/2/26

22 鸡胚模型的意义 生理情况下．新生血管形成主要发生在胚胎发育和女性月经周期内膜修复过程：在某些病理情况下。如损伤修复、炎症等也常伴发血管生成。特别是肿瘤生长和转移与血管生成密切相关。早在1912年，鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)模型首次成功用于肿瘤研究。 鸡胚对抑制血管生成的药物较敏感．是一种较理想的研究抗血管形成药物的筛选模型．是研究血管形成和抗血管形成的最佳体内模型之一。 模型优点：快速、灵敏、简单、廉价。 以新生血管为靶点的抗肿瘤治疗，其优势主要表现在：①肿瘤血管内皮细胞是药物经静脉途径首先到达的部位；② 血管内皮细胞基因状态比较稳定，不易产生耐药性；③ 肿瘤血管内皮细胞的有限损害就可造成大量肿瘤细胞的生长抑制；④抗肿瘤血管治疗具有一定的广谱性；⑤选择性高，对正常组织细胞极少影响。 2017/2/26

23 操作过程 获取种蛋，于37℃，55％相对空气湿度下孵育，每天翻动3次； 孵育至第七天，无菌条件下加药： 确定气室及胚头位置
75%酒精清洗卵壳，无菌眼科镊、剪在气室处开窗，直径为2.0cm左右，小心移去蛋壳及其内侧的壳膜，观察绒毛膜尿囊血管生成情况 设置对照组和实验组：对照组加生理盐水，实验组按照预先设定的药物浓度分别加药，药物加在无菌滤纸薄片上，置薄片于血管较细、密度较小部位 胚头右下0.5～1cm处开窗。 2017/2/26

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25 小心把对照组和实验组放回温箱， 37℃，55％相对空气湿度，3%CO2浓度继续孵育，但不再翻动
孵育至第8～10天，连续观察结果并拍照记录。 对照组 高浓度药物实验组 2017/2/26

26 对照组 低浓度药物实验组 2017/2/26 中浓度药物实验组 高浓度药物实验组

27 解剖显微镜下以相同放大倍数计数血管，以实验部位边缘(即徽孔滤膜载体边缘) 1mm范围内为一级血管，5mm范围内为二级血管．凡属趋向性生长的血管，即以载体为中心发出，与滤膜半径的夹角小于45°者均计数，而穿行，绕行的血管则不计算在内．一、二级血管分别观察计数，然后对一、二级血管数分别进行统计学分析和拍照记录。 2017/2/26

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29 注意事项 药物加入时间选择： 鸡胚绒毛尿囊膜的血管生成大约经历早期、中期和晚期3个阶段。早期胚胎的第5～7天，毛细血管网以出芽的方式形成新生血管；中期胚胎发育的第8～12天，套叠生长是主要的生长方式；而晚期胚胎的第l3～l4天，血管结构已经基本成熟，此时的血管形成主要以毛细血管网的膨胀方式进。 因此，选择胚胎4～10天进行抗血管形成试验，此时血管形成以出芽和套叠的方式进行，处于血管生长高峰阶段，便于结果的观察。 2017/2/26

30 药物载体的选择： 在CAM 法中，固态待测物可直接加入，液态物质需要适宜载体，使药物在局部缓释起效及定位．常用的药物戴体有 (1)明胶海绵，(2)中速定性滤纸，(3)快速定性滤纸，(4)混合纤维素滤膜，(5)双蒸水配制浓度为0.5％ 的M-450甲基纤维素溶液。高温高压灭，150ｕl甲基纤维素溶液分6次加入直径为5mm 的半圆形模具中，60℃ 烤箱烘干成盘状，80℃烤箱中烘烤60min消毒，备用．前四种载体制成直径5mm的圆片，湿热灭菌，4℃冰箱保存备用。 2017/2/26

31 鸡胚模型的应用 CAM模型用在肿瘤研究、子宫内膜异位症发病研究
目前，抑制肿瘤血管形成已被公认为一种崭新的抗癌战略，以肿瘤血管生成为靶点，开发血管生成抑制剂在抗肿瘤研究中是一个新的活跃研究领域。抗血管生成治疗的研究现已推广到新生儿血管瘤病、类风湿性关节炎、银屑病、糖尿病性视网膜病变等疾病的治疗；而促血管生成对心血管疾病、胃肠道消化性溃疡等疾病的治疗也有一定的意义。 2017/2/26