讨论课.

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1 讨论课

2 PCR产物 A-T克隆 测序 重组表达载体 原核表达载体 真核表达载体 病毒表达载体 昆虫表达载体 酵母表达载体 制备抗体 重 组 蛋 白 检测活性 体内、体外 转 染 细 胞 作用机制 应用

3 步骤： (1)PCR (2)核酸的纯化：凝胶回收Kit (3)连接反应：16℃过夜/22 ℃ 2h (4)CaCl2法制备感受态细胞：Kit
(5)宿主菌的转化及蓝白筛选 (6)挑克隆：2ml 含抗生素的LB (7)提质粒：Kit (8)重组质粒的鉴定：双酶切反应、菌落PCR (9)测序：生物技术服务公司 (10)菌种保存: 20~30%甘油-菌液，-20/-70 ℃

4 (11)外源基因在哺乳动物细胞中的表达：质粒转染、电转染
(12)目的基因表达的鉴定：RT-PCR、Northern Blot、 原位杂交、Southern Blot (13)目的蛋白表达的检测： 原核表达：SDS-PAGE (重组蛋白诱导表达的诱导剂浓度、 诱导时间和温度、重组蛋白表达的形式)、WB 真核表达：Western Blot、ELISA、免疫组化

5 (14)重组蛋白的纯化：亲和层析，His-tag/GST-tag
(15)制备抗体：多抗和单抗 (16)基因功能检测：提高/降低表达水平 细胞周期检测：流式细胞仪 细胞增殖检测：MTT 细胞凋亡检测: 流式细胞仪、TUNEL、DNA Ladder 抑瘤活性检测：体外、体内 对血管化的影响 。。。。。。。 (17)作用机制

6 方法的分类： 1. 核酸的分离纯化和鉴定: 基因组DNA、总RNA、质粒 2. 基因的克隆与鉴定方法 3. 外源基因转移技术和表达体系
4. 检测方法：电泳技术：agarose、SDS-PAGE 分子杂交: SB、NB、WB、基因芯片技术 DNA序列测定 生物信息学分析技术 5. 基因功能研究的方法 6. 组学研究技术：基因组学、蛋白质组学

7 实验一：A-T克隆 1. PCR：Pfu, 加A尾；[0922/8:00/a 张秀娟]
2. Agarose电泳：Gelred染色; [0922/b王楠 ] 3. 核酸纯化：凝胶回收Kit; [0922/18:30/c穆新燕] 4. Agarose电泳：检测回收条带; [0922/b] 4. 连接反应：pGMT, 4℃过夜; [0922/d刘静轶] 5. 转化：Top10, 热激法，蓝白筛选。[0923/8:00/e宋何煜 ] 实验一：A-T克隆

8 实验二：A-T克隆 1. 挑克隆：2ml 含抗生素的LB + 1个克隆；[0928/8:00/f田士军]
2. 提质粒：Kit；[0929/8:00/g徐菲一] 3. 重组质粒的鉴定：双酶切反应，37 ℃2h；[0929/h李纯] 4. Agarose电泳：Goldview染色；[0930/8:00/b] 5. 测序和序列比对：生物技术服务公司； [0930/h] 6. 菌种保存：20~30%甘油-LB，-20/-70 ℃。 [0930/h] 实验二：A-T克隆

9 1.PCR PCR 琼脂糖凝胶电泳 最终产物 紫外灯观察 3 - 4 小时

10 组成 a.模板DNA：单链或双链DNA, 避免DNA聚合酶抑制剂和能结合 b.引物：人工合成的两段与待扩增靶DNA侧翼片段互补的寡核苷酸。
0.1~0.5 µmol/L c.Mg2+的浓度：反应产物的特异性和产量，1.5mmol/L。 d.dNTP：50~200µmol/L，四种dNTP浓度相同。 e.Taq 酶：Klenow / Taq酶 / 高保真Taq酶, 2.5U/100μl 。 f.参数：94℃ 5min - 30×(94℃ 30sec - 55 ℃ 30sec - 72℃1 min) - 72 ℃7min

11 思考题1： 做PCR实验之前，你应该做哪些准备工作？ 1.目的片段大小 2. 仪器设备 3. 试剂 4. PCR参数

12 影响因素 模板：ng级的质粒DNA，μg级基因组DNA。 引物：特异性 dNTPs浓度：正确性和产量 Taq酶用量：非特异性
循环参数：常规为25~30个循环

13 思考题2： 下图是PCR结果，每个泳道的模板不同，你如何改进PCR条件 使得A、B、C和D样品能得到特异性好的目的条带？
Fig2 A B C D E 特异性条带弱，非特异性条带弱 无特异性目的带，非特异性条带弱 特异性条带明显，非特异性明显 特异性条带弱，非特异性显著 无特异性目的带，非特异性条带强

14 请设计将mda-7基因的CDS插入到真核表达载体pSecTag2A中的上下游引物。
思考题3： 载体信息 目的片段酶切位点 读框

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16

17 上游有标签 下游有标签 读框 终止码 不用

18 上游引物 1 atg aat ttt caa cag agg ctg caa agc ctg tgg act tta gcc aga 45
M N F Q Q R L Q S L W T L A R 15 5’ 保护碱基+ 酶切位点+ 起始密码 +目的基因5’末端序列 3’ 上游有标签 读框

19 下游引物: 反向互补 586 ctt ctg acc tgg atg cag aaa ttc tac aag ctc tga 621
L L T W M Q K F Y K L * 5’ 保护碱基+ 酶切位点+ 终止密码 +目的基因3’末端反向互补序列 3’ 下游有标签 读框

20 6 7 上游引物 下游引物 M17 5’ ccc a’ag ctt a atg aat ttt caa cag agg 3’ HindⅢ
。。。。 下游引物 M20 5’ gg g’gt acc gt gag ctt gta gaa ttt ctg 3’ KpnI 6 7 。。。。 5’ ccc aag ctt a 3’ ggg ttc gaa t ac ggt acc cc 3’ tg cca tgg gg 5’

21 18 M17 5’ ccc a’ag ctt atg aat ttt caa cag agg 3’ HindⅢ a

22 a Hind Ⅲ + 5’ AAGCCT 3’ 3’ TTCGAA 5’ 5’ A 3’ 3’ TTCGG 5’ 5’ AGCCT 3’
M17 5’ ccc a’ag ctt atg aat ttt caa cag agg 3’ HindⅢ

23 CG/2 30 42 M20 5’ gg g’gt acc gag ctt gta gaa ttt ctg 3’ KpnI gt

24 gt KpnⅠ CG + 5’ GGTACC 3’ 3’ CCATGG 5’ 5’ GGTAC 3’ 5’ C 3’ 3’ C 5’
M20 KpnI 5’ tag aaa ttc tac aag ctc ggt acc cc 3’ M20 3’ cc c’ca tgg ctc gaa cat ctt aaa gat 5’ KpnI M20 5’ gg g’gt acc gag ctt gta gaa ttt ctg 3’ KpnI

25 X A/AB A/AB 上游引物 下游引物: 反向互补 5’ 保护碱基+ 酶切位点+ 起始密码 +目的基因5’末端序列 3’
5’ 保护碱基+ 酶切位点+ 起始密码 +目的基因5’末端序列 3’ 上游有标签，注意读框 A/AB 下游引物: 反向互补 X 5’ 保护碱基+ 酶切位点+ 终止密码 +目的基因3’末端反向互补序列 3’ 下游有标签，注意读框 A/AB

26 2.琼脂糖电泳 思考题4： 你如何评价下图所示PCR电泳结果？为什么？如有问题如何解决？ 电泳染料 PCR

27 3.回收 4.连接与转化：4/16 ℃，22 ℃，热激法 5.挑克隆和提质粒 6.双酶切 7.菌种冻存

28 思考题5： 你用热激法将连接产物转化到细菌中，LB-Amp平板没有 克隆，请分析可能的原因。 1.LB平板的抗性 2.感受态细菌
3.连接产物

29 实验结果分析： 10个克隆，3个阳性，1个测序完全正确。

30 思考题6： 一位同学未能将PCR产物连入表达载体，请分析可能是哪些环节出问题？ 1.引物设计：内切酶，保护碱基 2.回收—双酶切—回收—连接
3.载体

31 8.诱导表达: IPTG，温度 9.超声碎菌：低温 10.SDS-PAGE (1)配胶：分离胶浓度，胶凝时间，储存 (2)上样：30μl/次/道 (3)电泳：90V---120V (4)染色 (5)脱色

32 实验三：重组蛋白在细菌中的诱导表达 转化：BL21, 热激法；[0928/8:00/i杨海强]
挑克隆： 2ml Kan+-LB + 1个克隆；[0929/8:00/f] 转接：20μl过夜菌+ 2ml Kan+-LB, 2管; [0930/8:00/j戴蒙] 诱导：0.5mM和0.1mM的IPTG（终浓度）; [0930/j] 碎菌：超声处理; [1013/ 8:00/k 张妮] SDS-PAGE：10%分离胶，考兰染色，脱色。[1013/l吴昊]

33 实验四：Western-blot SDS-PAGE：10%分离胶；[1013/m吴晓燕] 转膜：湿转；[1013/n李金龙]
封闭：RT 1h；[1013/o侯雷] Ab1：4 ℃过夜 ；[1013/o] Ab2：RT 40min ；[1014/8:00/p娄亮亮] ECL：RT 5min ；[1014/p]

34 His6-Pr 0.1mM IPTG 0.5mM IPTG M 未诱导 全菌 上清 沉淀 全菌 上清 沉淀

35 11. WB 1.样品：裂解，超声，离心，低温，总蛋白浓度测定 2.SDS-PAGE: 分离胶浓度(MW)
3.转膜：- 滤纸-胶- NC膜-滤纸 +，转膜条件(MW) 4.丽春红染色：丽春红 5.封闭：5％脱脂奶粉-TBST，RT 1h 摇床 6.Ab1：1:50~1:3000(封闭液)，RT 1h /4℃过夜 7.洗膜：TBST，RT 1h， 换液，摇床 8.Ab2：1:3000 (封闭液) ， RT 40min，摇床 9.洗膜：同前 10.ECL显色：RT5min，暗室，X-光片

36 His6-Pr 未诱导 全菌 上清 沉淀 0.1mM IPTG IB: His

37 思考题7： WB实验中的影响因素有哪些？如果你得到的是没有任何条带的白板，你准备怎么办？ 样品，电泳，转膜，一抗，二抗，ECL

38 思考题8： 实验室现有的试剂如下： 1M Tris-HCl，1M KCl，Triton X-100 (液体)，30.5% MgCl2(MW95)； 已知1×反应 buffer中各试剂需要量是：10mM Tris HCl, 50mM KCl, 1% Triton X-100, 1.5mM MgCl2。 现在要配5ml的10×反应 buffer，如何用现有试剂配制？请列出计算过程。 1X buffer 10X buffer 5ml 10X buffer 10mM Tris HCl 100mM Tris HCl (5mlX100mM)/1000mM=0.5ml 1M Tris HCl 0.5ml 50mM KCl 500mM KCl (5mlX500mM)/1000mM=2.5ml 1M KCl 2.5ml 1% Triton X-100 10% Triton X-100 5mlX10%=0.5ml Triton X ml 1.5mM MgCl2 15mM MgCl2 (5mlX15/1000M) =0.023ml 30.5%X10g/L 95 30.5% MgCl ml H2O ml

39 思考题9： 我们实验课用过哪些仪器设备？使用时最需要注意的分别是什么？ 离心机：样品配平和对称放置 PCR仪：禁止低于室温保存
电泳仪：电压不能过高 超声破碎仪：探头侵入液面 超净工作台：紫外灯照射 凝胶成像仪 细菌用恒温摇床 孵箱 水平摇床 水浴锅 金属浴

40 思考题： “基因” 概念—历史—特点—应用 对于一个分子生物学的关键词/术语，你有哪些想法？ 2.你如何理解研究思路和实验技术之间的关系？
“基因” 概念—历史—特点—应用 2.你如何理解研究思路和实验技术之间的关系？ “建筑/文章” 相辅相成，缺一不可

41 3.你认为在公共实验室做实验应该注意哪些问题？请从正、反两方面说明。
安全 做：规定(仪器、试剂、耗材、垃圾)，整洁 看和问： 教 ： 4.如果你做某个实验，三次都未得到你想要的结果，你准备下一步怎么办？ 停----想(设计—操作—结果分析)----问----想----看----想----做

42 5. 在分子生物学实验技术中，你掌握得最好的有哪些？最不了解的呢？最想知道的呢？请各列出三个。
6. 就这次课的内容，你认为还可以从哪些角度进行mda-7/IL-24的研究？请说明原因。 7. 请从讲课内容、安排时间和授课方式上，谈谈你对“生物化学与分子生物学实验技术”这门课程的建议。

43 感谢大家 对这门课程的关注和参与！

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