蛋白质免疫印迹技术及 常见问题分析 张绍进.

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1 蛋白质免疫印迹技术及 常见问题分析 张绍进

2 Western Blot简介 Western Blot一般流程 Western Blot常见问题分析

3 Western Blot 简介： 印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。
1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNA－RNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。 而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法。

4 Western Blot 基本原理 Western Blot 间接法基本原理：首先利用SDS-PAGE对蛋白质样品进行分离，然后转移到固相载体（例如NC膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。转移后的NC膜就称为一个印迹（blot）,用于对蛋白质的进一步检测。印迹首先用蛋白溶液（如5%的BSA或脱脂奶粉溶液）处理以封闭NC膜上剩余的疏水结合位点，而后用所要研究的蛋白质的抗体（一抗）处理，印迹中只有待研究的蛋白质与一抗特异结合形成抗原抗体复合物，而其它的蛋白质不能与一抗结合，这样清洗除去未结合的一抗后，印迹中只有待研究的蛋白质的位置上结合着一抗。处理过的印迹进一步用适当标记的二抗处理，二抗是指一抗的抗体，如一抗是从鼠中获得的，则二抗就是抗鼠IgG的抗体。处理后，带有标记的二抗与一抗结合形成抗体复合物可以指示一抗的位置，即是待研究的蛋白质的位置。目前有结合各种标记物的抗特定IgG的抗体可以直接购买作为二抗，最常用的一种是酶连的二抗，印迹用酶连二抗处理后，再用适当的底物溶液处理，当酶催化底物生成有颜色的产物时，就会产生可见的区带，指示所要研究的蛋白质位置。该技术广泛应用于检测蛋白水平的表达。 在Western Blot实验中，还有另一种方法，就是直接标记一抗，再用底物显色，这种方法叫直接法。与用二抗的间接法相比有诸多不足，标记二抗可用于很多种不同特异性的一抗，避免了标记很多一抗的需要，同时因为一抗结合不止一个二抗分子，所以二抗可以增强信号。所以一般情况下都釆用间接法进行检测。

5 Western Blot 优点 高分辨率的电泳技术 特异敏感的抗原-抗体反应 1-5ng中等大小的靶蛋白
Western Blot结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异敏感等多种优点，可检测到低至1～5ng（最低可到10－100pg）中等大小的靶蛋白。

6 Western Blot应用 目的蛋白的表达特性分析 目的蛋白与其它蛋白的互作 目的蛋白的组织定位 目的蛋白的表达量分析

7 Western Blot 流程 蛋白样品的制备 SDS-PAGE 转膜 封闭 一抗杂交 二抗杂交 底物显色

8 蛋白样品的提取 通过有机溶剂或水溶法制备总蛋白 水溶液提取法
针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂 。 有机溶剂提取法 对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取，包括乙醇、丙酮和丁醇等。 通过层析或电洗脱法制备目的蛋白 1. 蛋白样品的制备(Protein sample preparation) 蛋白提取的质量直接决定着 WB 结果的好坏，因此，根据标本类型和检测类型选择合适的蛋白制备方法是至关重要的！ 使用适当的裂解液裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。对于某些特定的亚细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用商业化的试剂盒进行抽提。 一般实际用的比较多的是 RIPA裂解液，配方：50 mM Tris-HCl pH 7.4、150 mM NaCl、1 mM PMSF、1 mM EDTA、1% Triton x-100、1%脱氧胆酸钠、0.1% SDS。 样品提取以“快速彻底裂解，先变性后保存”的原则比较有效，尽量选择足够强的裂解液，然后取出部分蛋白定量，其余加入上样缓冲液 100℃充分变性，再分装保存于-20℃ 。

9 蛋白样品的定量 蛋白质浓度测定的各种方法汇总：
目前常用比色法测定样品蛋白的含量：Bradford法（考马斯亮蓝法）、Lowry法（Folin-酚试剂法）、 BCA法等。但各有优缺点，大家可以根据具体情况选取。按相应蛋白质定量试剂盒操作说明操作，测定样品浓度。 蛋白质浓度测定的各种方法汇总： 收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大，大家可以根据具体情况选取。 Bradford法（考马斯亮蓝法） 考马斯亮蓝G-250有红、蓝两种不同颜色的形式，在一定浓度的乙醇和酸性条件下，可配成淡红色的溶液，与蛋白结合后形成蓝色化合物，该化合物在595nm处有最大吸收值，化合物颜色深浅与蛋白的浓度高低成正比。 该法操作简便迅速，消耗样品量少，但不同蛋白质之间差异大，且标准曲线线性差。高浓度的Tris、EDTA、尿素、甘油、蔗糖、丙酮、硫酸铵和去污剂对测定有干扰。缓冲液浓度过高时，改变测定液pH值会影响显色。 Lowry法（Folin-酚试剂法） 福林-酚试剂（Folin-phenol reagent）的显色原理是：首先在碱性条件下蛋白质与铜作用生成蛋白质-铜复合物，该复合物随之将磷钼酸-磷钨酸还原成蓝色复合物。在一定条件下，蓝色强度与蛋白质量成正比，蛋白质浓度范围约在25～250 μg/mL。 虽然该法是测定蛋白质浓度应用最广泛的方法之一，但其缺点也很明显，专一性较差，干扰物质多（如Tris缓冲剂、蔗糖、硫酸铵、巯基化物、酚类、柠檬酸等），标准曲线的直线关系不特别严格。因此在其应用过程中有很多新的修正。 BCA法（二喹啉甲酸法） 二喹啉甲酸(Bicinchoninic acid，BCA )法是Lowry测定法的一种改进方法，是近来广为应用的蛋白定量方法。其原理与Lowery法蛋白定量相似，即在碱性条件下蛋白质分子中的肽键能与Cu2+络合生成络合物，同时将Cu2+还原成Cu+。二喹啉甲酸及其钠盐是一种溶于水的化合物，在碱性条件下，可以和Cu+结合形成稳定的紫蓝色复合物，在562 nm处有高的光吸收值，并且化合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，据此可测定蛋白质浓度。 与Lowery法相比，BCA蛋白测定方法操作更简单，试剂及其形成的颜色复合物稳定性更好，几乎没有干扰物质的影响，灵敏度高（微量检测可达到0.5μg/ml），应用更加灵活。与Bradford法相比，BCA法的显著优点是不受去垢剂的影响。 BCA法与Lowry法都容易受到蛋白质之间以及去污剂的干扰。Bradford 法敏感度最高，且与一系列干扰Lowry，BCA 反应的还原剂（如DTT，巯基乙醇）相容。但是对于去污剂依然是敏感的，其最主要的缺点是不同的标准品会导致同一样品的结果差异较大，无可比性。

10 蛋白样品的变性 2×SDS-PAGE上样缓冲液：
DTT可临用前以1：4比例混合加入，亦可全部配好分装，-20℃冻存。 按1:1比例与蛋白质样品混合，95～100℃加热5～15min，冰上冷却后再上样，上样量一般为20-25μl，总蛋白量20～50μg。 100mM Tris-HCl(pH6.8) 200mM DTT 4%SDS 0.2%溴酚兰 20%甘油 ddH2O 1M Tris-HCl(pH6.8) 10 ml 1M DTT 20 ml SDS 4 g 甘油 溴酚蓝 0.2 g 总体积 100ml 取相同质量的细胞裂解液（体积×蛋白质浓度），并加等体积的2×电泳加样缓冲液。电泳样品加入样品处理液后，要经过高温处理，其目的是将SDS 与蛋白质充分结合，以使蛋白质完全变性和解聚，并形成棒状结构。样品处理液中通常还加入溴酚蓝染料，溴酚蓝指示剂是一个较小的分子，可以自由通过凝胶孔径，所以它显示着电泳的前沿位置，当指示剂到达凝胶底部时，即可停止电泳。另外样品处理液中也可加入适量的蔗糖或甘油以增大溶液密度，使加样时样品溶液可以沉入样品凹槽底部。至此，电泳样品已准备就绪，可立即使用也可以分装冻存，-20℃存放的样品可稳定保持数月。

11 SDS： 阴离子去污剂 变性剂 氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS胶束。
阴离子去污剂 变性剂 氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS胶束。 蛋白质-SDS胶束所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，消除了不 同分子之间原有的电荷差异。 与强还原剂一起使蛋白分子氢键、疏水键打开，使蛋白质分子线性化。 SDS 是一种离子性的界面活性剂，它有强离子性的硫酸根离子也带有疏水性的长碳链。当SDS与蛋白质混合时，它会以其碳链与蛋白质之疏水性氨基酸结合将蛋白质包起来，而以硫酸根离子外露与水分子作用。大多数蛋白质和SDS的平均结合量是 1：1.4 (以重量为单位)，而蛋白质结合固定比例之SDS后，由于SDS带强负价，使蛋白质原先的带电价微不足道，且每单位重量之蛋白质带电价一致 (charge density)，所以决定不同蛋白的泳动速率就只剩下分子大小一项因素。

12 蛋白质-SDS胶束的特点： （1）具有相同的形状，形状像一个长椭圆棒 （2）平均1g 蛋白质结合1.4g SDS
（4）长轴的长度则与亚基分子量的大小成正比

13 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 不连续的电泳缓冲体系。
SDS - Sodium Dodecyl Sulfate PAGE - Polyacrylamide Gel Electrophoresis

14 【SDS-PAGE基本原理】 SDS-PAGE 是在蛋白质样品中加入SDS和含有巯基乙醇的样品处理液，SDS是一种很强的阴离子表面活性剂，它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。 强还原剂巯基乙醇（或二硫苏糖醇，DTT）可以断开二硫键破坏蛋白质的四级结构。使蛋白质分子被解聚成肽链形成单链分子。解聚后的侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物。 蛋白质分子结合SDS阴离子后，所带负电荷的量远远超 过了它原有的净电荷，从而消除了不同种蛋白质之间所 带净电荷的差异。蛋白质的电泳迁移率主要决定于亚基 的相对分子质量，而与其所带电荷的性质无关。

15 凝胶成分 丙烯酰胺和N,N’-亚甲双丙烯酰胺  SDS 配胶的Tris缓冲液 TEMED 过硫酸铵 Tris-甘氨酸电泳缓冲液
聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gel, PAG）是由单体丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂(crosslinker)N,N’-亚甲基双丙烯酰胺(N,N’-methylenebisacylamide，简称Bis)在加速剂四甲基乙二胺(TEMED)和催化剂过硫酸铵(AP) 的作用下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶。PAG机械强度好，有弹性，透明，化学性质稳定，是良好的电泳介质，改变Acr浓度或Acr与Bis的比例可以得到不同孔径的凝胶。以此凝胶作为支持介质的电泳称为PAGE（Polyacrylamide Gel Electrophoresis）。 PAGE具有电泳和分子筛的双重作用。

16 PAGE：聚丙烯酰胺凝胶 聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel)是由单体丙烯酰
胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂(crosslinker) N,N’-亚甲基双丙烯酰胺(N,N’-methylenebisacylamide， 简称Bis)在催化剂和加速剂作用下聚合交联而成的三维网 状结构的凝胶。化学惰性强，具有一定的机械强度和透明 度。是良好的电泳介质。

17 聚丙烯酰胺凝胶的聚合方式： 单体：丙烯酰胺（Acr）； 交联剂：甲叉双丙烯酰胺（Bis）； 催化剂：过硫酸胺或核黄素（AP）；
加速剂：四甲基乙二胺（TEMED）； 产物：三维网状结构凝胶 影响聚丙烯酰胺凝胶聚合的因素：试剂的纯度；温度；氧气；AP、TEMED原则：尽量少的催化剂并在最佳时间内聚合。 聚丙烯酰胺凝胶聚合机理是通过提供氧游离基(free radicals)的催化，使体系发生氧化还原作用(catalyst-redox systems)来完成的。催化体系主要有化学催化（AP—TEMED）和光化学催化（核黄素——TMTED）体系。

18 凝胶浓度与蛋白分离范围 凝胶浓度（％） 线性分离范围（KD) 15 12-43 10 16-68 7.5 36-94 5.0 57-212 SDS-PAGE浓缩胶(5% Acrylamide)及分离胶配方表：

19 不连续电泳： 作用 缓冲液PH 凝胶浓度 电泳缓冲液：pH8.3 Tris-甘氨酸系统。 浓缩胶 使蛋白样品浓缩 pH6.8Tris-Cl
低，2-5% 分离胶 使蛋白样品分离 pH8.8Tris-Cl 高，根据蛋白大小 PAGE分为连续系统和不连续系统两大类。连续系统电泳体系中缓冲液pH值与凝胶中的相同。带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。不连续系统中带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应、分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。 电泳缓冲液：pH8.3 Tris-甘氨酸系统。

20 灌制分离胶 隔绝空气 ddH2O 0.1%SDS:<8% 异丁醇：>8% 2. 电泳(Electrophoresis)
灌制分离胶 隔绝空气 ddH2O 0.1%SDS:<8% 异丁醇：>8% 2. 电泳(Electrophoresis) 2.1 SDS-PAGE凝胶配制 配制相应浓度的SDS-PAGE分离胶，TEMED加入后迅速混匀制胶，沿壁迅速灌注分离胶溶液，留出积层胶所需空间（梳齿长再加1cm）。覆盖5mm水(或异丙醇）层于分离胶溶液上，约30-60min后分离胶和水层之间会出现清晰界面，表明分离胶充分聚合（可微微倾斜模具，检测凝胶是否聚合）。 ddH2O轻轻洗涤凝胶顶部数次，以除去未聚合的凝胶，再用滤纸吸净残留液体，注意不要接触胶面。 覆盖层可保持胶面平整和防止空气进入，因为氧气扩散进入凝胶会抑制聚合反应。 灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型。 胶浓度＜10%时可用0.1%的SDS封，浓度＞10%时用水饱和的异丁醇或异戊醇，也可以用0.1%的SDS。封胶后切记，勿动。

21 灌制积层胶 插入梳子 配制相应体积的积层胶液体，在已聚合分离胶上直接灌注积层胶液体，立即插入加样梳，并在空隙处补足积层液液体（小心避免混入气泡），室温静置30～60min至完全聚合，将凝胶固定于电泳装置上，上、下槽加入Tris甘氨酸电泳缓冲液，至少要淹没加样孔。小心拔出加样梳，避免损坏加样孔，如加样孔有气泡，可向其中加入适量电泳缓冲液将气泡驱除；若上样孔有变形，可用适当粗细的针头拨正。 凝胶的质量直接影响以后的实验结果，要特别注意几点：凝胶要均一没有气泡；积层胶与分离胶界面要水平；AP和TEMED的量不能过多，太多会导致胶易脆裂；拔梳子时要快，尽量保证点样孔平整。

22 Staking gel Separating gel 2.2 样品处理
取20～50µg总蛋白量（根据自己的实验需要进行选择，没有固定的量）的蛋白样品，按1：1体积比加入2上样缓冲液，加相同蛋白量体积不同时以1样品缓冲液配平上样体积后，于95～100℃加热5～15min使蛋白充分变性，保证蛋白质从空间结构变为一级结构。 2.3 上样与电泳 冰上冷却后，把将处理好的蛋白样品按照预定的顺序上样到SDS-PAGE胶加样孔内中。注意的是加样孔有多时，可加入等体积的上样缓冲液，最后记得点上预染蛋白质分子量Marker。预染Marker便于在电泳过程中监测蛋白质分离，也可以在随后的转膜步骤中指示转移效率。 Marker也用1样品缓冲液调整至与样品等体积。 电泳时通常推荐在上层胶时使用低电压恒压电泳，而在溴酚蓝进入下层胶时使用高电压恒压电泳。对于Bio-Rad的标准电泳装置或类似电泳装置，低电压可以设置在80-100V，高电压可以设置在120V左右。当溴酚蓝到达凝胶底部附近时即可停止电泳，或者可以根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况，预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。 注意事项： 1.抗原样品与缓冲液混合水浴加热时不要进水！最好采用空气浴； 2.电泳Buffer最好不要重复利用，因为样品比较珍贵，而电泳液相对廉价； 3.Buffer一定要漫过梳子孔，否则就会发现蛋白跑不动； 4.电泳时先用低电压跑过浓缩胶，再换高电压跑分离胶，不要追求速度，慢慢跑条带会分离的更好，特别是对于高分子量的目的蛋白。

23 转膜 要将电泳后分离的蛋白质从凝胶中转移到固相载体（例如NC膜）上，通常有两种方法：毛细管印迹法和电泳印迹法。
常用的电泳转移方法有湿转和半干转。两者的原理完全相同，只是用于固定胶/膜叠层和施加电场的机械装置不同。 3. 转膜(Transfer) 毛细管印迹法是将凝胶放在缓冲液浸湿的滤纸上，在凝胶上放一片NC膜，再在上面放一层滤纸等吸水物质并用重物压好，缓冲液就会通过毛细作用流过凝胶。缓冲液通过凝胶时会将蛋白质带到NC膜上，NC膜可以与蛋白质通过疏水作用产生不可逆的结合。这个过程持续过夜，就可以将凝胶中的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上。但是这种方法转移效率低，通常只能转移凝胶中的一小部分蛋白质（10%-20%）。而电泳印迹可以更快速有效的进行转移。这种方法是用有孔的塑料和有机玻璃板将凝胶和NC膜夹成“三明治”形状，而后浸入两个平行电极中间的缓冲液中进行电泳，选择适当的电泳方向就可以使蛋白质在电场力的作用下离开凝胶结合到NC膜上。

24 转移膜的选择 最常用于Western Blot的转移膜主要是硝酸纤维素（Nitrocellulose，NC）膜和聚偏二氟乙烯 （Polyvinylidene Fluoride, PVDF）膜，此外也有用尼龙膜、DEAE纤维素膜做蛋白印迹。尼龙膜和NC膜的特点相似,主要用于核酸杂交。 各种膜的详细特点介绍： 硝酸纤维素（nitrocellulose, NC)膜：NC与蛋白质靠疏水作用结合，无需预先活化，对蛋白质的活性影响小； 非特异性本底显色浅； 价格低廉，使用方便。但结合在NC上的小分子蛋白质在洗涤时易丢失； NC韧性较差，易损坏。 聚偏二氟乙烯(Polyvinylidene fluoride, PVDF)膜：与蛋白质亲和力高，用前需在甲醇中浸泡，以活化膜上的正电基团，使其更容易与带负电荷蛋白结合。 膜的选择主要根据： a.膜与目的蛋白分子的结合能力（也就是单位面积的膜能结合蛋白的载量），以及膜的孔径（也就是拦截蛋白的大小）； b.不影响后续的显色检测（也就是适和用于所选的显色方法，信噪比好）； c.如果后继实验有其他要求，比如要做蛋白测序或者质谱分析，还要根据不同目的来挑选不同的转移膜。

25 湿转系统 湿转是一种传统方法，将胶/膜叠层浸入缓冲液槽然后加电压。这是一种有效方法但比较慢，需要大体积缓冲液且只能用一种缓冲液。另外用这种方法转移双向电泳中常规使用的大胶比较困难。 湿转操作步骤： 1、起胶：将凝胶从玻璃板中取出，切除积层胶及溴酚蓝下部的分离胶，剩下的含有目的蛋白的分离胶浸泡于转膜缓冲液中，防止胶凝固、变形。 2、润湿：准备2张Whatman 3#滤纸、1张NC膜，尺寸与凝胶大小相仿（滤纸与胶一样大，膜比胶大一些）， NC膜先放入水中3分钟，再放入转膜缓冲液中10分钟。（若用PVDF膜，应先在100%甲醇中浸泡，否则很难润湿。甲醇可反复利用。） 3、三明治的制作：按顺序在转移夹内放置预先经转移缓冲液浸泡的海绵、1层Whatman 3#滤纸、凝胶、硝酸纤维素膜、1层Whatman 3#滤纸、海绵，保证每层之间没有气泡。组装顺序：转膜夹黑色面（负极）－海绵垫－滤纸－胶－ 膜－滤纸－海绵垫－红色面（正极） 切记：每层之间用滴管/玻棒将其中的气泡全部赶出，绝不允许气泡存在！ 4、转膜：将转移夹放入转移槽，加入4 ℃预冷的转膜缓冲液，将凝胶面与负极相连，硝酸纤维素膜与正极相连。 关于转膜电流和时间: 一般转膜的电流在200mA-400mA之间，转膜时间为30-60分钟。也可以在15-20mA转膜过夜。大片段的>50KD的可以选用350mA,小片段的可以用250mA,上述电流均能很好的把大部分蛋白转过去。具体的转膜时间要根据目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的转膜时间越长，目的蛋白的分子量越小，需要的转膜时间越短。 关于转膜的注意事项： 1.胶在负极，膜靠近正极； 2.转膜缓冲液一定要事先预冷，最好提前一天配好放4 ℃ 冰箱； 4.滤纸不要大过膜，防止短路； 5.夹好膜和凝胶后，确定在凝胶/膜和滤纸之间没有气泡存在，否则会导致转膜不完全； 6.注意一定要戴手套或用塑料镊子接触膜，因为手上的蛋白和油脂会影响转膜效率并会使膜脏掉； 7.在转膜过程中，特别是高电流快速转膜时，通常会有非常严重的发热现象，最好把转膜槽放置在冰浴中进行转膜。

26 半干转移系统 半干转移用浸透缓冲液的多层滤纸代替缓冲液槽。因为电极板直接与滤纸接触，使凝胶中电场强度尽可能大以快速高效转移。与湿转相比，这种方法又快（15-45 分钟）又好。多数半干转移方法使用一种以上的缓冲系统，可以同时高效转移大小不同的蛋白。然而，半干转移系统因缓冲液较少不适于长时间转移。 半干转操作步骤与湿转基本类似，区别在于两边都是3层Whatman 3#滤纸，转移电压和时间也有所不同。 半干转移系统中，滤纸和膜切成与凝胶相同大小很重要，这样电流必须通过凝胶。否则，在凝胶边缘处滤纸重叠将导致电流短路。 两种转移系统中都必须注意防止在滤纸、凝胶和膜之间的任何地方存在气泡，气泡阻碍转移并在印迹膜上产生“秃斑”（即非转移区）。 小分子量的蛋白半干转效果比较好，大分子量（100KD以上）建议湿转。

27 转膜后检测（此步可以省略） 丽春红染色 蛋白带出现后，于室温用去离子水漂洗硝酸纤 维素滤膜，换水几次。 印度墨汁染色
只用于放射性标记抗体或放射性标记A蛋白探 针的Western印迹过程。 转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的TBST（或PBST）中漂洗1-2分钟，以洗去膜上的转膜液。 从转膜完毕后所有的步骤，一定要注意膜的保湿，避免膜的干燥，否则极易产生较高的背景。 转膜的效果可以观察所使用的预染蛋白质分子量标准，通常分子量最大的1-2条带较难全部转到膜上。转膜的效果也可以用丽春红染色液对膜进行染色，以观察实际的转膜效果。也可以用考马斯亮蓝快速染色液对完成转膜的SDS-PAGE胶进行染色，以观察蛋白的残留情况。 印度墨汁不能和化学发光物合用，若是使用呈色反应的酶检测法时，印度墨汁的黑色会使凝胶难于拍照。这时，可改用其他检测方法或换用丽春红S。 转膜后检测，多用丽春红染色，可见多条粉红色条带。 按照所检测蛋白分子量大小切下膜条，做好标记。

28 封闭 为避免作为检测试剂的特异性第一抗体与膜发生非特异性结合，使非特异性背景提高，需对膜上的潜在结合位点进行封闭处理。
5%脱脂奶粉或BSA（室温孵育1h） Western Blot 膜封闭液（生物试剂公司） Tween-20的作用：减少非特异性吸附，不影响抗体与抗原的结合。 4. 封闭(Blocking) 杂交膜上有很多非特异性的蛋白质结合位点，为防止这些位点与抗体结合引起非特异的染色和背景，一般用惰性蛋白质或非离子去污剂封闭膜上的未结合位点来降低抗体的非特异性结合。封闭剂应该封闭所有未结合位点而不替换膜上的靶蛋白、不结合靶蛋白的表位，也不与抗体或检测试剂有交叉反应。常用的封闭试剂有 5%的 BSA 或者脱脂奶粉，缓冲液一般选择 PBST 或者TBST。 将膜从电转槽中取出，去离子水与PBST或TBST稍加漂洗，浸没于封闭液中缓慢摇荡一小时。必要时可先用丽春红染色（2%乙酸，0.5%丽春红的水溶液）观察蛋白条带，再用去离子水和TBST将丽春红洗脱后封闭，如用蛋白marker则可省略此步。 一般封闭条件为：室温或者 37℃缓慢摇荡1～2h，特殊情况也可 4℃过夜。根据结果情况调整封闭试剂的浓度和类型。比如有时 BSA 比脱脂奶粉更有利于降低非特异性背景，而有些抗体则在脱脂奶粉封闭的情况下才能得到清晰的背景。 封闭完成后要进行洗膜，以去除膜上未结合的封闭试剂。洗涤液使用TBST 或者PBST。

29 一抗、二抗孵育 把NC膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据膜面积以0.1mL/cm2的量加入一抗溶液，摇床上平缓摇动，于室温孵育1-2小时或4℃过夜。 回收一抗溶液，用TBST漂洗膜3次，每次10min。 加入用封闭液配制的二抗，摇床上缓慢摇动，于室温孵育1-2小时或4℃过夜。 最后用TBS漂洗膜2次，每次10min。 5. 一抗孵育(Primary antibody incubation) 5.1 参考一抗的说明书，按照适当比例用封闭液稀释一抗。 5.2 吸尽封闭液后，立即加入稀释好的一抗，室温或4℃在摇床上缓慢摇动孵育1～2小时。如果一抗孵育一小时效果不佳，可以在4℃缓慢摇动孵育过夜。 5.3 回收一抗。然后加入Western洗涤液，在摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液，洗涤5-10分钟。共洗涤3次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。 6. 二抗孵育(Secondary antibody inucubation) 6.1 参考二抗的说明书，按照适当比例用封闭液稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗。 6.2 吸尽洗涤液后，立即加入稀释好的二抗，室温或4℃在摇床上缓慢摇动孵育1～2小时。 6.3 回收二抗。然后加入Western洗涤液，在摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液，洗涤5-10分钟。共洗涤3次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。 前2步洗涤是为了洗去一抗和二抗的非特异性结合，洗涤的效果直接影响结果背景的深浅，所以洗涤一定要干净。洗涤液使用 TBST 或者 PBST，其中的 Tween20 有助于去除非特异性的结合，减少背景。同时短时间多次的洗膜（如 5-6次，每次 3分钟）比长时间少次数的洗膜更有效。 第3步TBS洗涤是为了洗去膜上的Tween20，因为它可以阻碍底物的沉积。 一抗、二抗的浓度一般要参照抗体说明书选择最适当的比例，一抗二抗的选择直接影响实验结果以及背景的深浅。要严格保证反应时间，洗膜要注意尽可能地将一抗二抗洗净，有利于降低背景；还要注意一抗二抗的匹配。

30 二抗与底物反应显色 辣根过氧化物酶法（HRP） 碱性磷酸酶法（AP） 化学发光显色法(HRP)
7. 蛋白检测(Detection of proteins) 在酶连抗体中使用的酶通常是碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。碱性磷酸酶可以将无色的底物5-溴-4-氯吲哚磷酸盐(BCIP)转化为蓝色的产物；而辣根过氧化物酶可以以H2O2为底物，将3-氨基-9-乙基咔唑氧化成褐色产物或将4-氯萘酚氧化成蓝色产物。另一种检测辣根过氧化物酶的方法是用增强化学发光法，辣根过氧化物酶在H2O2存在下，氧化化学发光物质鲁米诺(luminol，氨基苯二酰一肼)并发光，在化学增强剂存在下光强度可以增大1000倍，通过将印迹放在照相底片上感光就可以检测辣根过氧化物酶的存在。 ① HRP标记二抗用DAB显色，按顺序依次将DAB三种剂各取3滴于5ml蒸馏水中，避光混匀，将膜加入显色液中避光显色5-15min终止反应，对照Marker记录实验结果，将NC膜晾干扫描保存 ② AKP标记二抗用AP显色，在10mlAKP缓冲液中加入66µlNBT溶液和33µl BCIP溶液混匀，室温下将膜放入显色（37℃可加速反应）5-15min。对照Marker记录实验结果，将NC膜晾干扫描保存。 ③底物发光法：将两种显色底物1：1等体积混合后将其覆盖在膜表面使其均匀，用玻璃胶片把膜包起来，马上在暗室中将X光片覆盖在膜的上面（时间根据光的亮度来衡量），显影、定影。（荧光在一段时间后会越来越弱，要控制好时间） 除了酶连二抗作为指示剂，也可以使用其它指示剂，比如：荧光素异硫氰酸盐标记的二抗（可通过紫外灯产生荧光）；生物素结合的二抗等等。

31 膜解吸方法（膜的重复利用） 通过加热和去污剂进行解吸 原理：组合使用去污剂和加热使抗体解离，适用于任何化学发光底物系统。 酸解吸
原理：使用低pH改变抗体结构从而使结合位点失活，从而将抗体与抗原分离，适用于任何化学发光底物系统。 8. 膜的重复利用(Membrane recovery) 如果蛋白样品非常宝贵，可以使用Western一抗二抗去除液处理蛋白膜，以重复利用蛋白膜。 两种方法都不能去除由显色检测系统产生的有色沉淀物（例如BCIP、4-CN、DAB和TMB）。然而，仍可以用针对不同靶蛋白的特异性抗体分析印迹膜。 重要提示：在各次免疫检测之间不应使印迹膜干燥。印迹膜干燥将会使任何剩余抗体与膜永久性结合。 通过加热和去污剂进行解吸 仪器和溶液： 解吸液：100mM 2-巯基乙醇，2%（w/v）SDS，62.5 mM Tris-HCl，pH6.7 磷酸盐缓冲液（PBS）：10mM 磷酸钠，pH7.2，0.9%（w/v）NaCl 浅托盘，大小足以将膜放入其中。 操作： 1. 在通风橱中，将印迹膜放入解吸液中在50℃下振摇30分钟。 2. 将印迹膜放入缓冲液中振摇10分钟。用新缓冲液重复漂洗两次。 3. （可选）重复起始检测方法（忽略一抗步骤），确保已灭活抗体或已从膜上解吸抗体。 4. 将印迹膜放入缓冲液中振摇10分钟。 5. 继续下一轮检测的封闭步骤。 酸解吸 解吸液：25mM 甘氨酸- HCl，pH2，1%（w/v）SDS 1. 将印迹膜放入解吸液中振摇30分钟。 2. 将印迹膜放入缓冲液中振摇10分钟。用新缓冲液重复漂洗。 3. 继续下一轮检测的封闭步骤。

32 Western Blot结果分析 目的蛋白的灰度值除以内参的灰度值以校正误差，所得结果代表某样品的目的蛋白相对含量。
Western Blot结果分析软件Gel-Pro Analyzer 4 绿色版（附动画演示教程） 9. 结果分析(Result Analysis) 内参即是内部参照，对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。 在Western Blot中使用内参其实就是在WB过程中另外用内参对应的抗体检测内参，这样在检测目的产物的同时可以检测内参的表达，由于内参在各组织和细胞中的表达相对恒定，借助检测每个样品内参的量就可以用于校正蛋白质定量、上样过程中存在的实验误差，保证实验结果的准确性。此外使用内参可以作为空白对照，检测蛋白转膜情况是否完全、整个Western Blot显色或者发光体系是否正常。 常用的蛋白质内参有GAPDH和细胞骨架蛋白beta-actin或beta-tubulin。一般要选择一个在处理因素作用的条件下蛋白含量不会发生改变的蛋白作内参。 为了让实验更加严谨有说服力都要设计对照实验，对照分为：阳性对照（最好有标准品（比如β-actin，GAPDH）或阳性血清）；阴性对照（测血时用相应小鼠未免疫血清（即正常血）；空白对照（不加一抗，用PBS代替）；无关对照（用无关抗体）。 成功进行 Western Blot 检测，设置合适正确的对照是必不可少的，只要正确设置了这些对照，即可快速和准确的找到 Western Blot 的问题所在， 并保证实验结果的准确性和特异性！一般需要设置的对照如下： 阳性对照：明确表达检测蛋白的组织或细胞，用于检测抗体的工作效率； 阴性对照：明确不表达检测蛋白组织或细胞，用于检测抗体的特异性； 二抗对照：不加一抗，用于检测二抗的特异性； 内参对照：检测标本的质量和二抗系统； 空白对照：不加一抗和二抗；用于检测膜的性质和封闭的效果

33 Western Blot常见问题分析

34 SDS-PAGE电泳 胶板洗刷干净 加入AP和TEMED的量要合适 加入试剂后摇匀，使其充分混合，防止部分胶块聚合不均匀 胶不平？
温度合适，受热不均匀导致胶聚合不均匀 两块玻璃板底部要对齐 胶不平？ 凝胶漏液？

35 SDS-PAGE电泳 凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量混合均匀，动作轻缓 拔梳子要迅速，清洗加样孔要小心，以免把上样带扭曲
样品盐浓度过高会挤压其他条带导致宽窄不一，纯化样品，调整盐浓度 胶板底部有气泡会影响电泳效果，应赶走气泡。同时注意电泳槽装置是否合适 条带比正常的窄？ “微笑”或“倒微笑”条带？

36 转膜及抗体检测 可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲液中浸泡5-10min 凝胶肿胀或卷曲？
电转仪长期使用导致海绵变薄，“三明治”结构不紧凑导致。可在两块海绵之间垫上少许普通的草纸 确保膜和胶块之间没有气泡 缓冲液中离子浓度太低，电流或电压太高。转膜过程注意降温 凝胶肿胀或卷曲？ 条带歪斜或漂移？ 单个或多个白点？ 转膜缓冲液过热？

37 转移到膜上的蛋白很少 对 策 蛋白分子量<10KD时，减少转膜时间；使用小孔径的膜 原因 更换高pH值Buffer
蛋白的等电点< 9 SDS浓度不合适 凝胶太厚 原因 对 策 蛋白分子量<10KD时，减少转膜时间；使用小孔径的膜 更换高pH值Buffer 在阴极buffer中加入 % SDS 可提高转膜效率 延长转膜时间

38 背景太高 对 策 原因 转膜前用100%甲醇将膜完全浸湿 膜没有均匀浸湿 拿取膜与吸水纸时要戴手套，更换新鲜转膜缓冲液 膜或者缓冲液污染
封闭不充分 抗体与封闭剂出现交叉反应 抗体浓度过高 原因 对 策 转膜前用100%甲醇将膜完全浸湿 拿取膜与吸水纸时要戴手套，更换新鲜转膜缓冲液 检测一抗、二抗与封闭剂是否有交叉反应 杂交前检测一抗、二抗的工作浓度

39 杂交信号很弱 对 策 原因 抗体长期保存应在－70℃，使用前做效价检测 增加蛋白上样量，做已知标准量蛋白的对照 抗体保存不当 抗原不充足
膜的漂洗过度 原因 对 策 抗体长期保存应在－70℃，使用前做效价检测 增加蛋白上样量，做已知标准量蛋白的对照 减少漂洗的时间和次数

40 出现非特异带 对 策 原因 制备单克隆抗体或者重新选取合成抗原多肽的位点 一抗不是唯一特异的
二抗出现非特异结合 原因 对 策 制备单克隆抗体或者重新选取合成抗原多肽的位点 设立不加一抗，只加二抗的平行对照来检测二抗是否有非特异结合

41 Further Readings 生物秀Western Blotting专题
Millipore的蛋白印迹手册 Bio-Rad的western Blotting操作手册 Western blot问题解答专帖

42 谢谢大家！