认知侵袭性真菌感染的 实验室诊断 汇报人 杨烨建.

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1 认知侵袭性真菌感染的 实验室诊断 汇报人 杨烨建

2 何为侵袭性真菌感染?

3 DFI（deep fungal infection）
真菌侵犯毛发、表皮、甲床以外的组织（皮下组织、黏膜、肌肉、内脏器官、中枢神经系统等）引起的感染。

4 IFI（invasive fungal infection）
DFI中急、危、重者。真菌在组织器官或血液中生长繁殖，导致炎症反应和组织器官损伤，常伴多器官功能障碍。

5 IFD（invasive fungal disease）
2007年欧洲癌症治疗研究组织(EORTC)侵袭性真菌感染协作组(IFICG)和美国国立变态反应与传染病研究所霉菌病研究组(NIAID-MSG)将IFI改称IFD。国内未获响应，现仅用于侵袭性念珠菌病(invasive candidosis,IC)和曲霉病(invasive aspergillosis,IA)。

6 IFI诊断依据

7 IFI诊断依据 EORTC和NIAID/MSG 2007年修订标准,国内各学会诊治指南。IFI诊断分级： 拟诊（possible）
临床诊断（probable） 确诊（proven）

8 IFI分级诊断标准 诊 断 级 别 高 危 因 素 临 床 特 征 微生物学 检 查 组织病理 学 证 据 拟 诊 + - 确 诊

9 有确诊价值的微生物学检查 （1）血液真菌培养阳性，但曲霉、青霉（马尔尼菲青霉除外）需排除污染。
（2）导管相关性真菌血症，导管培养与血培养均阳性，且为同一真菌。 （3）胸水真菌培养阳性。 （4）肺组织真菌培养阳性。 （5）合格痰标本或BALF镜检发现肺孢子菌包囊、滋养体或囊内小体。 （6）胸水、CSF、血液直接镜检发现新生隐球菌。 （7）直接导尿培养念珠菌>105CFU/ml。

10 常见IFI病原的诊断

11 常见IFI病原（1）念珠菌属（Candida）
以下列念珠菌属最常见: 白色—（C.albicans）、光滑—（C.glabrata）、 热带—（C.tropicalis）、近平滑—（C.parapsilosis）、克柔—（C.krusei）、都柏林—（C.dubliniensis）、季也蒙—（C.guilliermondii）。 北京大学人民医院血液科(2004.4~2005.2间)165株念珠菌，其中： 白念78.8%，其他念珠菌21.2%； 张红金等2006.1~6月ICU患者并发IFI 137例，其中： 白念65株（47.4%）、光滑36株（26.3%）、热带28株（20.4%）、平滑5株（3.6%）、克柔2株（1.5%）、青霉1株（0.7%）。

12 IC发病的重要前提是念珠菌定植 单因素分析:
念珠菌定植、WBC＜0.5×109/L持续＞10d、使用碳青霉烯类抗生素是恶性血液病患者发生IC的危险因素； 多因素分析: WBC＜0.5×109/L持续＞10d是IC唯一危险因素。

13 常规检查 （1）革兰染色、乳酸酚棉蓝染色，镜检4~6μm圆或卵圆芽胞，可见出芽，假菌丝。
用含荧光增白剂（Calcofluor White ，CFW）的10%~20% KOH涂片，紫外线激发呈蓝白或绿色荧光。 （2） 培养于沙氏培养基生长乳白色酵母样菌落； 玉米粉-Tween80琼脂生长假菌丝、厚壁孢子；  CHROMagar培基上（35℃）菌落呈色：白念-绿色，热带-蓝灰，粉红、边缘模糊-克柔。 其他种为白色至粉红色。血清（鸡蛋清）中37℃ 2~3h白念产生芽管。 种间鉴别用糖发酵和糖同化试验。

14 血清学试验 （1）测抗原 胞壁1,3-β-D-葡聚糖（G试验），表面抗原甘露聚糖（LA试验），热不稳定蛋白（LA试验），胞浆蛋白烯醇化酶（ELISA和WB），Mr 65000蛋白（抑制ELISA）等。 （2）测抗体 烯醇化酶（P47）抗体（ELISA），白念珠菌芽管抗体（CAGTA）间接免疫荧光法。

15 分子生物学诊断 （1）以ITSI（internal transcribed spacer 1，内部可转录间隔区1）为靶基因的泛真菌PCR加DNA测序法（可测念珠菌、隐球菌、曲霉、镰刀菌等多种真菌）。 （2）泛曲霉念珠菌检测法（pan-AC assay）用种特异探计real-timePCR（常见的6种念珠菌、9种曲霉）。 （3）以28SrDNA为靶基因的real-timePCR。可测念珠菌、曲霉、隐球菌、毛霉、青霉等。 （4）多串连PCR（multiplex tandem PCR，MT-PCR）以ITS1、ITS2、EF1-α、β微管蛋白（β-tubulin）为靶基因，可测常见念珠菌、隐球菌、曲霉、镰刀菌、接合菌等。 （5）反向线点杂交（reverse line blot hybridization，RLB）和基因芯片（oligonucleotide microarray）技术。尚未获批准。

16 常见IFI病原（2）曲霉菌属（Aspergillus）
185个种中有20多个可致机会性感染 常见为: 烟曲霉（A.fumigatus）、黄曲霉（A.flavus）、黑曲霉（A.niger）。 棒曲霉（A.clavatus）、灰绿曲霉（A.glaucus）、构巢曲霉（A.nidulans）、米曲霉（A.oryzae）、土曲霉（A.terreus）、焦曲霉（A.ustus）、杂色曲霉（A.versicolor）也有报告。

17 曲霉菌孢子是链状的，成熟后脱落，2~5μm，易在空气中悬浮。
经空气吸入孢子致病，与定植无关。

18 曲霉鉴定主要依靠形态学特征 血清学试验：G试验，GM试验。 分子生物学诊断：同念珠菌属。
包括: 菌落颜色，分生孢子梗形态、颜色，产孢结构数目，顶囊形态等。 烟曲霉耐高温，40℃（38.5~50℃）生长良好。 血清学试验：G试验，GM试验。 分子生物学诊断：同念珠菌属。

19 常见IFI病原（3）隐球菌属（Cryptococcus）
--- 新生隐球菌（C.neoformans）， --- 有新生变种（var.neoformans）（血清型D型）， --- 格特变种（var.gatii）（B、C型）， --- grubii变种（var.grubii）（A型）。 在A、B、C、D、AD血清型中，我国已见A、D及AD型，A型最多。

20 感染途径： 鉴定要点： 经呼吸道吸入孢子（可从鸽粪、按树分离），侵犯肺与神经系统。
沙氏培养基25℃~37℃均生长。CSF直接或离心沉淀物涂片墨汁染色发现圆或椭圆双层厚壁孢子，外有宽荚膜。菌体可见单个出芽。

21 血清学试验： ELISA法： 分子生物学诊断：
隐球菌荚菌多糖抗原胶乳凝集试验(LA),试剂盒法国PaxtorexTM Crypto Plus,红色胶乳颗粒包被抗糖醛酸木糖甘露聚糖(GXM)单抗。 标本：血清、CSF、BALF、尿，血清和CSF用链霉蛋白酶56℃、30min预处理。 假阳性：RF>500IU/ml时(9/26)；TB患者血清(2/26)。1:4稀释转阴。 ELISA法： 多抗包被，酶标记单抗检测。不受RF干扰。 分子生物学诊断： 同念珠菌属。

22 组织病理中的隐球菌（PAS）

23 墨汁染色中的隐球菌

24 隐球菌性脑膜炎诊断 脑脊液检查 墨汁涂片 培养 动物接种 电镜观察 荚膜抗原乳胶凝集试验（LAT） 分子生物学的方法
涂片和培养对于诊断具有决定意义

25 直接墨汁涂片 阳性率大约为60% 优点：快速简便、可做菌体计数
当脑脊液中的菌体数较少 （低于103/mm3 ）常常会有假阴性结果，需要做进一步的检查

26 真菌培养 对本病的诊断有决定意义，是确诊的金标准 诊断的敏感性高于直接真菌涂片 脑脊液真菌培养的方法，对于培养的结果具有重要的影响

27 荚膜抗原乳胶凝集实验（LAT） LAT是以高效价的抗隐球菌荚膜多糖抗体吸附于标准大小的乳胶上，检测血清或CSF标本中的隐球菌荚膜抗原。
特异性接近100%，敏感性约为95% 与菌体计数具有平行性，对于预后判断有帮助

28 常见IFI病原（4）卡氏肺孢子菌（Pneumocystis carinii）
属真菌界，子囊菌门，古子囊菌纲，肺孢子菌目，肺孢子菌科，肺孢子菌属。 1909年Chagas首先发现（克氏锥虫），至上世纪80年代一直归为原虫（真菌培养基不生长；细胞膜无麦角固醇，对麦角醇合成抑制剂类抗真菌药耐药，但对抗原虫药敏感）。

29 直接镜检： 痰（30%）、BALF（75%）、经皮穿刺肺活检（60%）、开胸肺活检（95%）查找包囊等。染色法：Gomori’s环六亚甲基四胺银（GMS），亚甲胺蓝、荧光素染色（染包囊壁和囊壁括弧样结构）。 培养： Uero、CEI、WI-38、MRC-5和Chang肝细胞等。

30 血清学试验： 分子生物学诊断： 查抗原：荧光素标记单抗测标本中包囊、滋养体，阳性率97%~99%。
查抗体：ELISA、IIF、WB查抗体，阳性率50%~ 90%，假阳性率高。WB法测抗Mr 35000~45000抗体，提示活动感染。 分子生物学诊断： 同念珠菌属。

31 常见IFI病原（5）接合菌（Zygomycetes）
无性型在孢子囊内形成不能游动的静孢子，有性型形成接合孢子。 毛霉目（Mucorales）、虫霉目（Entomophthorales）中部分种可致毛霉病（mucormycosis）或接合菌病（zygomycosis）。

32 毛霉目中有7个科、12属、24种致病 毛霉属（Mucor）、根霉属（Rhizopus）、犁头霉属（Absidia）、根毛霉属（Mucor Rhizomucor）、被孢霉属（Mortierella）、共头霉属（Sycephalastrum）、小克银汉霉属（Cunninghamella）、瓶霉属（Saksenaea）等致病的种多。 吸入孢子、创伤感染、食入污染食物致病。特点是菌丝侵犯血管，引起栓塞、组织坏死、化脓性反应和肉芽肿。 最常播散至脑，鼻窦炎、眶窝织炎、肺炎。 鼻脑毛霉病占30%~50%，病死率80%~90%，次为肺、胃、肠毛霉病。

33 直接镜检标本中见90°角分支的宽大、透明、无分隔或极少分隔菌丝可诊断。确诊须从组织切片中找到菌丝。
虫霉目中1科、2属、3种致病： 蛙粪霉属(Basidiobolus)中的固孢蛙粪霉(B.haptasporus)，耳霉属(Conidiobolus)中的冠状耳霉(C.coronatus)和异孢耳霉(C.incongruus)。 传入途径: 微小外伤，昆虫叮咬。

34 直接镜检标本中宽大、不规则，无分隔的薄壁真菌菌丝及其片段。
分子生物学诊断：同念珠菌属。

35 常见IFI病原（6）双相型真菌 25℃菌丝相、37℃酵母相的致病真菌包括申克孢子丝菌，马尔尼菲青霉、荚膜组织胞浆菌、粗球孢子菌、巴西副球孢子菌、皮炎芽生菌等。 有的有地域分布特点； 对人致病力强，感染无须免疫受损。

36 申克氏孢子丝菌 镜下特征 纤细分支分隔菌丝 直角分枝的分生孢子梗，顶端梨形或圆形小分生孢子，呈“梅花瓣样”结构
有的小分生孢子沿菌丝两侧排列，呈“袖套状” 酵母相镜下可见革兰阳性卵圆形或梭形孢子

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39 马尔尼菲青霉（Penicillium marneffei）
自然界土壤、竹笋、甘蔗中（25℃）多以菌丝形式存在，组织中形成酵母样细胞，两端钝圆，有横隔。竹鼠为带菌动物。 吸入本菌孢子或食入霉变甘蔗发病。侵犯单核吞噬细胞系统，全身重要脏器均可受累。所致IFI 70%见于AIDS患者。

40 骨髓、外周血涂片，皮肤、淋巴结活检组织涂（切）片，溃疡分泌物涂片，巨噬细胞内外直径2~3μm，有1~3个横隔的椭圆（腊肠）形细胞。糖原染色可与黑热病LD小体和荚膜组织胞浆菌鉴别。
培养阳性为诊断金标准。阳性率骨髓100%，皮损90%，血液76%。血清学试验检测Mp1基因编码的本菌特异的胞壁甘露糖蛋白Mp1P抗原或其特异抗体。 分子生物学诊断：同念珠菌飞行属。

41 马尔尼菲青霉 鉴定依据 双相菌 直接或病理检查找到腊肠形孢子 菌落特征（培养基被染成红色）和镜下结构（帚状枝及孢间连体）
在察氏培养基上生长不良（麦芽汁培养基上生长良好）

42 菌丝相 酵母相

43 菌丝相(正面)

44 菌丝相(反面)

45 马尔尼菲青霉

46 腊肠形孢子

47 常见IFI病原（7）镰刀菌属（Fusarium）
某些种与大骨节病、克山病、食管癌有关，在真菌性角膜炎中占58.7%。可致心、脑、肺感染和真菌血症。 引起的IFI逐年增多，发病率、死亡率仅次于白念珠菌和曲霉所致感染。 吸入本菌致肺感染，类似IA。侵犯血管引起血栓致组织坏死。

48 特征： 典型镰刀形大分生孢子，大、小不等，有2～5个分隔。但即使多次分离出同一真菌也只能是疑诊。 确诊： 培养阳性，病理组织切片发现本菌。

49 介绍两个实验 GM试验 G试验

50 GM试验 检测曲霉半乳甘露聚糖（galactomannan,GM）抗原。 试剂盒：Bio-Rad公司 PLATELIATM Aspergillus EIA. 原理： 一步酶免疫夹心微孔板法……

51 结果解释： （1）GM连续2次阳性 有临床诊断价值。 （2）GM阴性不能排除IA（GM低于可测限）；高危患者应每周2次筛查。
（4）假阴性：见于慢性肉芽肿病，Job’s综合征及某些用抗真菌药治疗的IA患者。

52 （6）GM试验对中性粒细胞减少症IA患者诊断价值较高，对非中性粒细胞减少的IA诊断价值较差。
（5）假阳性： ①青霉属（Penicillium）、交链孢属（Alternaria）、拟青霉属（Percilomyces）、地丝菌属（Geotrichum），组织胞浆菌属（Histoplasma）真菌与EBA-2单抗有交叉反应。 ②某些谷类制品、乳脂点心中含半乳呋喃糖（galactofuranose），牛奶制品（humanized milks）含高浓度GM，常在婴儿造成GM假阳性。 ③某些批次半合成β内酰胺抗生素（piperacillin/tazobactam，amoxicillin与clavulanic acid）中含GM抗原。 （6）GM试验对中性粒细胞减少症IA患者诊断价值较高，对非中性粒细胞减少的IA诊断价值较差。

53 G试验： 检测真菌(念珠菌、曲霉、肺孢子菌等)壁1,3-β-D葡聚糖(glucan). 适用于念珠菌、曲霉、肺孢子菌、镰孢霉等引起的感染。 试剂盒: Glucatell (美国Cape Code公司), 2003年美国FDA批准, 美洲鲎: 界值60pg/ml。 Fungitec.G(日本Seikagaku Kogyo公司),东方鲎: 界值20pg/ml。 Goldstream(北京金山川公司): 界值20pg/ml。

54 试验原理 类似检测细菌内毒素的鲎试验(limulus lysate test),细菌内毒素/1,3-β-D-glucan激活鲎变形细胞裂解物中的凝固酶原，生成凝固蛋白，引起浊度/色度变化。根据标准曲线得出检样中1,3-β-D-glucan含量。

55 参考值 <10pg/ml。 结果解释（金山川试剂盒说明书） <10pg/ml 阴性，健康人
 >20pg/ml IFI（不能区分真菌种属）  以≥50pg/ml为阳性, 诊断IFI敏感性63.6%, 特异性90.8%.  Cut off值, 敏感性, 特异性尚待大规模临床验证。

56 几点建议 1、真菌感染检查知识普及，人才培训。 2、质优价廉的商品试剂盒供应。 3、产、学、研结合，研发验证新方法、新试剂。

57 IC和IA的相关血清学研究 分离提取白念珠菌烯醇化酶 基因工程制备白念珠菌烯醇化酶 动物模型考察侵袭性白念珠菌感染后抗体产生规律
制备烯醇化酶单克隆和多克隆抗体 蛋白质组学技术筛选烟曲霉优势抗原 巢式PCR技术检测烟曲霉DNA 用烟曲霉分泌蛋白检测侵袭性曲霉病人以及疾病模型动物抗体，评估诊断价值。

58 展望 血清学方法有益于IC的早期诊断； 目前市场提供诊断试剂品种少，检测的敏感性、特异性尚不能满足需要；

59 谢 谢！